miR-181b-5p促进肺癌干细胞样细胞发生上皮间质转化中的作用及机制研究

发布时间：2019-11-20 01:44

【摘要】：研究背景目前,非小细胞肺癌(NSCLC)的发病率约占全部肺部肿瘤发生率的80%-85%,是全世界范围内死亡率最高的肿瘤疾病。尽管最近10年,我们在肺癌发生的分子生物学机制的研究方面取得了长足的进步,并采取了包括手术切除、传统化疗、放疗、分子靶向治疗及免疫治疗等综合治疗手段,但是患者的5年生存率依然没有明显的改善,只有15.9%的肺癌患者能存活5年以上,绝大多数患者死于肿瘤的复发与转移。目前学术界普遍接受肿瘤干细胞假说:在恶性肿瘤组织中存在着具有干细胞样特性的细胞亚群,即肿瘤干细胞样细胞(cancer stem-like cells,CSLCs)或称肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TICs),其不仅具有自我更新和多向分化的能力,而且与肿瘤的发生、转移、复发及放化疗抵抗密切相关。肿瘤干细胞样细胞的存在已经在造血系统肿瘤及肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胶质瘤等多种实体恶性肿瘤的研究中得到了证实。目前多通过无血清悬浮培养成球富集技术或者利用细胞表面标志物进行流式细胞分选,对肿瘤干细胞样细胞进行分离与鉴定。研究显示,肺癌干细胞样细胞的细胞表面标志物主要包括:CD133+、CD326+、CD44+、CD166+、ALDH1A1+、Sca1+/CD34+(小鼠),等。这些表面标志物单独或者共表达在肿瘤细胞表面,作为肿瘤干细胞样细胞的识别分子,为以肿瘤干细胞样细胞为靶细胞的根治性研究提供了突破口。上皮细胞间质样改变(EMT)是指细胞形态从上皮细胞向间质细胞表型转化的过程。大量研究发现,EMT不仅参与胚胎发育、器官纤维化,并且在肿瘤侵袭和转移中也起着重要作用。在肿瘤细胞发生EMT的过程中,原来在上皮细胞表面表达的标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达减少,反而间质细胞表面标志物如波形蛋白(vimentin)、N型钙粘蛋白(N-cadherin)等表达上调,细胞失去极性,细胞间的连接变得疏松,胞内骨架蛋白发生重组,细胞的运动能力增加,进而促进肿瘤的侵袭与转移。EMT的过程受Wnt、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Notch等多种信号通路的调节。近年来的研究表明,microRNAs(mi RNAs)也参与肿瘤EMT过程。miRNAs是一类长约19~22个核苷酸(nt)的非编码单链小分子RNA。大量的研究证实,miRNAs通过诱导目的mRNA降解或抑制其翻译蛋白,在转录后水平调控该基因表达,发挥着类似癌基因与抑癌基因的角色,显示其作为肿瘤标志物、预后判断、疗效监测以及肿瘤靶向治疗新靶点的广阔应用前景。目前有研究表明,mi RNAs也参与到肿瘤EMT过程中的各个环节,miR-200家族通过调控ZEB基因的表达在抑制肿瘤EMT过程中起重要作用;而miR-214通过PI3K/AKT通路可诱导卵巢癌细胞发生EMT。MiRNAs在肿瘤干细胞样细胞和肿瘤细胞的EMT过程中均发挥着重要作用,其复杂而庞大的调节网络是目前研究的热点,然而,其中仍有很多疑问亟待探讨:如肿瘤干细胞样细胞本身是否会发生EMT?发生EMT的肿瘤干细胞样细胞是否是肿瘤侵袭、转移的根本原因?其过程是否受到miRNAs的调控?其机制如何,能否指导临床实践?本课题将围绕上述问题展开研究。研究目的1.诱导肺腺癌干细胞样细胞发生EMT。2.筛选出肺腺癌干细胞发生EMT前后差异表达的mi RNAs。3.验证差异表达的miRNA调控肺腺癌干细胞EMT的体内或体外的生物学行为变化并探讨其具体机制。研究方法一、诱导肺腺癌干细胞样细胞发生EMT1.对普通肺腺癌细胞A549进行无血清悬浮培养,诱导出富集成球的肺癌干细胞。2.利用流式细胞分选(FACS)筛选出CD133+/CD326+细胞,并利用裸鼠成瘤、定量PCR检测CD133、CD326、OCT-4和Nanog的表达和激光共聚焦技术(Confocal laser scanning microscope,CLSM)对其干性表达进行鉴定。3.TGF-β1诱导CD133+/CD326+细胞发生EMT,利用Transwell侵袭实验和实时定量PCR技术从形态学和基因水平对其进行验证。二、利用miRNAs芯片检测人肺腺癌干细胞样细胞诱导发生EMT前后miRNAs的差异表达,筛选出有意义的miRNAs。1.利用实时定量PCR miRNA芯片初步筛查检测A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+细胞和CD133+/CD326+细胞+TGF-β1 4组细胞,得到差异miRNAs表达谱。2.对差异miRNAs进行靶基因预测及功能分析,构建miRNA-gene-network调控网络图谱,筛选出有意义的目标miRNAs基因,并利用实时定量PCR技术对结果进行重新验证。三、验证miR-181b-5p调控肺腺癌干细胞样细胞EMT的体内或体外的生物学行为变化并探讨其具体机制1.mi R-181b-5p模拟物agomir和抑制剂antagomir构建。Agomir和antagomir转染A549和CD133+/CD326+细胞,实时定量PCR检测miR-181b-5p表达情况。2.实时定量PCR及Western blot检测E-cadherin表达。3.Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力改变,裸鼠转移瘤实验验证agomir转染后肿瘤转移灶形成能力。4.比较正常人与肿瘤患者外周血中的miR-181b-5p表达情况。研究结果1.成功建立肺腺癌干细胞样细胞EMT模型通过对普通A549细胞进行无血清悬浮培养,成功诱导出大量致密成球的肺腺癌干细胞样细胞球,并利用流式细胞分选技术进一步筛选出CD133+/CD326+细胞。干性鉴定实验证明CD133+/CD326+细胞具有干细胞特性,符合进一步实验标准。利用TGF-β1对收集的CD133+/CD326+细胞进行EMT诱导,其形态发生了明显的类间质变化,且实时定量PCR检测EMT相关基因发生明显正向改变,Transwell侵袭实验证实细胞的侵袭转移能力得到提升。因此,我们确认已经成功建立肺腺癌干细胞样细胞EMT模型。2.筛选出肺腺癌干细胞样细胞EMT相关基因miR-181b-5p利用实时定量PCR miRNA芯片对A549,A549+TGF-β1,CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1 4组细胞进行组间miRNAs的差异表达,得到差异miRNAs表达谱。对差异miRNAs进行维恩图分析,找到特异与共有的差异mi RNAs进行后续分析。通过Targetscan和miRanda数据库进行靶向基因预测并计算结合分值和结合位点。对靶基因根据KEGG数据库进行显著性Pathway分析,找到miRNA靶基因所参与的信号转导通路。以mi RNAs与基因之间的关系,构建相互作用网络,找到网络中核心调控能力的miRNAs和受miRNAs调控影响最大的基因。利用实时定量PCR技术对筛选出来的miRNAs进行验证,提示只有miR-181b-5p的表达趋势符合芯片数据和实验设计,且miR-181b-5p在A549及肿瘤干细胞样细胞诱导EMT过程中均高表达。因此,mi R-181b-5p是下一步研究的目标分子。3.miR-181b-5p通过下调E-cadherin表达,促进肺腺癌干细胞样细胞发生EMT并促进肿瘤转移构建mi R-181b-5p模拟物agomir和抑制剂antagomir并转染到A549和CD133+/CD326+细胞,实时定量PCR检测miR-181b-5p表达,结果显示agomir和antagomir分别促进和抑制miR-181b-5p的表达。Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力改变,结果提示转染agomir后A549、A549+TGF-β1、CD133+/CD326+和CD133+/CD326++TGF-β1这4组细胞的侵袭能力均得到增强;而转染antagomir后其侵袭能力得到不同程度的下降。说明miR-181b-5p表达量与细胞的侵袭能力成正相关。通过实时定量PCR技术检测转染agomir和antagomir前后细胞的EMT相关基因表达情况,发现E-cadherin基因的表达趋势与miR-181b-5p表达量呈相反趋势,miR-181b-5p过表达显著抑制E-cadherin表达;Western blot检测E-cadherin蛋白的表达情况进一步确认上述结论,提示E-cadherin基因可能是miR-181b-5p的下游靶基因。通过向裸鼠移植瘤定期注射agomir的方法,我们可以看到注射agomir后的裸鼠发生肿瘤转移的情况明显增多。进一步比较正常人与肿瘤患者外周血中的miR-181b-5p表达情况,结果显示肿瘤患者的外周血中miR-181b-5p表达普遍升高。研究结论miR-181b-5p通过下调E-cadherin表达,促进肺腺癌干细胞样细胞EMT形成过程,增强了癌细胞侵袭转移能力,促进裸鼠转移瘤的形成,初步临床实验也显示mi R-181b-5p与肺癌淋巴结转移相关,并在肿瘤患者外周血中高表达。因此,mi R-181b-5p对肺癌诊断和分期具有进一步研究和应用的重要价值。
【图文】：

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图 1 肿瘤干细胞转移假说示意图（引自 Adrian, et al. Cancer Metastasis Rev. 2012）近年来，随着在人类中数目约为 2588 个（2014 年 6 月，miRBase 21.0）调控性非编码小分子 RNA（microRNAs，miRNAs）的逐步发现，为该领域的研究带来新的希望。MiRNAs 是一类约 19～22nt 的小分子没有具体蛋白编码作用的单链 RNA，，其编码基因位于用来翻译蛋白质的遗传基因中间，通过一系列的剪切，由初始的 miRNA转变成成熟的 miRNA，并与目标 mRNA 的 3'非翻译区基因完全或不完全互补配对，抑制蛋白质翻译过程[14]。现已明确，miRNAs 介导的信号通路是干细胞维持干性(stemness)的基础，miRNA对胚胎干细胞或成体干细胞的自我更新、分化和增殖具有重要的调控性作用。在不同发育阶段、分化进程中出现特定的 miRNAs，能决定细胞的分化方向以及分化时相。据估计，miRNAs 大约调控着人类全基因组中三分之一的基因[15]。与此同时，microRNAs 表达和很多的癌症有关系，差不多为 50%的 microRNA 在遗传位点上位置

肿瘤转移,信号通路,编码基因,灰色

第三军医大学博士学位论文源进行鉴定，与传统的病理分类方法相比具有无可比拟的精细程度，仅仅依靠数百条miRNAs 分子，可望完成几万个 mRNA 或蛋白分子也不能完成的肿瘤分子分型[16]。MiRNAs 参与肿瘤转移越来越多地得到证实，许多 miRNA 参与癌细胞扩散过程的调控，通过同时作用多条信号通路并靶向不同目标基因蛋白而对癌细胞扩散起激活或抑制的功能（图 2）。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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