CUL4B对肿瘤诱导的髓系抑制细胞的调控作用及其机制

发布时间：2019-11-26 18:43

【摘要】：肿瘤的建立和进展需要有利于其生存的环境,即肿瘤微环境。肿瘤微环境中除含有肿瘤和宿主细胞分泌的多种可溶性因子和细胞外基质外,还包括内皮细胞、周细胞、成纤维细胞和免疫细胞等多种非肿瘤细胞。通过这些分子和细胞的相互作用,肿瘤微环境不仅能提供肿瘤生长、发展和转移所需要的组份(细胞和分子),而且能有效地保护肿瘤细胞免受宿主免疫系统的监视和攻击。髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是肿瘤微环境中促进肿瘤生长和形成免疫抑制微环境的重要细胞群。MDSCs是一群异质性的细胞群,由处于不同分化阶段的髓系细胞组成。在正常生理条件下,来源于骨髓的未成熟髓系细胞会迅速分化为三种成熟的髓系细胞,即巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞,这些细胞是机体固有免疫和适应性免疫所必需的。但在肿瘤、自身性免疫反应、慢性感染等病理性条件下,髓系细胞分化受阻,导致未成熟的髓系细胞累积,并获得免疫抑制功能。在小鼠中,MDSCs共表达CD11b和Gr-1标志物。根据抗原表位和形态不同,MDSCs可以分为单核样和粒细胞样MDSCs。MDSCs通过多种途径抑制机体固有免疫和适应性免疫,其作用主要通过表达高水平的精氨酸酶1 (Arginase-1, ARG1)和诱导性NO合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS),产生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)和一氧化氮(Nitric oxide, NO),以及释放IL-10、TGF-p等抑制性细胞因子。目前,有关MDSCs的研究大多局限于其表型分析和促肿瘤生长作用,对于调控其活化以及累积的细胞内信号途径知之甚少。CUL4B属于CULLIN基因家族,该家族成员编码的蛋白质是CULLIN-RING泛素连接酶(CRL)复合物的支架蛋白。CRLs是目前已知的E3泛素连接酶中最大的一类,其主要作用是识别并泛素化特异性的底物,从而参与调节包括细胞周期、细胞信号转导、基因转录、和生物体个体生长发育等重要生命活动。近期研究还发现CUL4B在多种实体瘤中高表达,通过转录抑制一组抑癌基因表达而发挥癌基因作用。作为重要的转录调控因子,CRL4B通过单泛素化H2AK119,协同转录抑制复合物PRC2、SUV39H1/HP1/DNMT3A复合物等调控组蛋白甲基化和DNA甲基化。人类CUL4B基因突变导致X连锁精神发育迟滞综合征,我们实验室前期发现的家系患者除表现出显著的智力低下表型外,还伴有身材矮小、失语、短指、巨舌以及单核细胞增多的现象。到目前为止,已经有超过20个X连锁精神发育迟滞综合征家系患者被报道携带CUL4B突变。基因敲除小鼠研究表明,全身性敲除小鼠Cul4b基因导致胚胎早期死亡,我们的研究发现杂合子雌鼠由于胎盘血管发育异常而出现宫内发育迟缓。这些研究提示CUL4B在多个系统的发育过程中发挥重要作用。基于上述事实,本研究将利用条件性敲除小鼠模型分析CUL4B在血细胞分化和血管新生中的作用。第一部分Cul4b条件性敲除小鼠的建立与表型分析我们的前期研究结果显示Cul4b敲除杂合子小鼠宫内发育迟缓是由于胎盘血管发育异常所致；CUL4B突变的X连锁精神发育迟滞综合征患者表现出单核细胞增多的表型。这些结果使我们有理由相信CUL4B在血管新生和血细胞分化中发挥重要作用。为验证这一假设,本部分我们首先建立并分析了内皮细胞和造血祖细胞特异性敲除Cul4b基因的Tek-Cre条件性敲除小鼠。1.建立Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-条件性敲除小鼠模型：Tek-Cre转基因小鼠CRE酶的表达受Tek基因启动子和增强子调控,Tek基因在内皮细胞和造血祖细胞中表达。为获得组织特异性敲除小鼠,我们将实验室前期构建的Cul4bflox/flox基因打靶小鼠与Tek-Cre+/-转基因鼠交配,获得Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-条件性敲除小鼠(Cul4bCKO)；我们分别利用免疫组化、Western Blot和实时定量RT-PCR方法证实Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-敲除小鼠的内皮细胞和造血细胞中CUL4B得到有效敲除。2. Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-小鼠的表型：我们对Cul4b CKO小鼠和野生对照小鼠的主要组织进行HE染色,结果显示Cul4b CKO小鼠没有明显的组织学异常；外周血有核细胞进行计数分析未发现白细胞主要亚群在两种基因型小鼠间的明显差异,而流式检测结果显示Cul4b CKO小鼠外周血、脾脏以及骨髓中都有CD11b+Gr-1+细胞群的累积,未发现其它成熟的细胞亚群比例的明显变化,分析这群细胞对T细胞增殖的影响发现这群细胞获得了免疫抑制能力。第二部分宿主造血系统CUL4B缺失促进肿瘤生长并伴随MDSCs累积与活化上部分结果显示造血系统CUL4B缺失导致CD11b+Gr-1+细胞群累积,而且累积的这群细胞具有抑制T细胞增殖的能力,因为这群细胞(即MDSCs)在肿瘤诱导下迅速累积并促进肿瘤的生长与转移,为此,本部分利用移植瘤模型分析了CUL4B缺失对MDSCs的影响。1.造血系统中CUL4B缺失促进移植瘤生长：我们向Cul4b CKO小鼠及其对照小鼠皮下接种B16/F0与EL4移植瘤,结果显示CUL4B缺失导致肿瘤细胞在Cul4bflox/Y Tek-Cre+/-小鼠体内更为迅速地生长。2.造血系统中CUL4B缺失促进MDSCs的累积：流式细胞术检测两组荷瘤小鼠外周血、脾脏、骨髓以及肿瘤组织中MDSCs的比例,结果显示MDSCs田胞群在Cul4b CKO小鼠体内的累积明显多于野生对照小鼠,并且这种累积现象在MDSCs的两个亚群中都存在；为了排除Cul4b CKO小鼠体内MDSCs累积的增多是肿瘤生长更速度快带来的效应,我们在荷瘤6天时进行上述组织的流式检测,结果显示在这个肿瘤生长没有差异的时间点,MDSCs细胞群在两种基因型小鼠中的累积已经存在显著差异,证实了CUL4B对MDSCs累积的负调控作用。3. CUL4B缺失的MDSCs介导了Cul4b CKO小鼠体内肿瘤更快的生长：我们采用MDSC/EL4肿瘤细胞混合移植的模型以及骨髓移植模型检测了CUL4B缺失导致的移植瘤生长速度加快是否是MDSCs介导的,结果显示混合CUL4B缺失MDSCs的肿瘤细胞在野生型小鼠体内生长更为迅速；移植了CUL4B缺失MDSCs的受体小鼠体内肿瘤生长更快并伴随受体小鼠自体MDSCs更快的累积。4.造血系统中CUL4B缺失促进机体的免疫耐受：有报道称MDSCs在抑制机体免疫反应的同时可以抑制机体的免疫排斥反应,促进机体产生免疫耐受。为了检测Cul4b基因敲除是否改变机体的免疫耐受能力,我们利用BaBL/c小鼠来源的乳腺癌细胞系4T1对两种基因型小鼠进行皮下接种,结果显示CUL4B缺失的小鼠可以耐受4T1肿瘤细胞生长,而野生对照小鼠完全排斥了异源肿瘤的生长。5.造血系统中CUL4B缺失增强MDSCs的免疫抑制能力：MDSCs的免疫抑制功能主要表现在对T细胞功能的抑制,我们对MDSCs免疫抑制能力的检测结果显示：在体外共培养实验中,CUL4B缺失的MDSCs两个亚群对CD4+或CD8+T细胞的增殖都有更明显的抑制作用。在荷瘤小鼠体内,Cul4b CKO、鼠肿瘤组织内浸润的CD4+和CD8+T细胞比例都明显低于野生型,与此一致的是,CUL4B缺失后荷瘤小鼠外周血以及脾脏中T细胞两个亚群的比例也都显著降低；同时,CUL4B缺失后MDSCs胞内发挥抑制作用的效应分子的表达水平普遍有所升高,对应的效应产物ROS以及NO的释放也明显增多,证实CUL4B对MDSCs活化的负调控作用。6. CUL4B缺失导致MDSCs分化异常：为了探究CUL4B缺失导致MDSCs累积加快的原因,我们对MDSCs的增殖和凋亡情况进行了检测,结果并未发现MDSCs的增殖与凋亡在两种基因型间存在差异；接下来,我们检测了CUL4B缺失后造血祖细胞向MDSCs分化的能力,流式检测结果显示CUL4B缺失的造血祖细胞分化为MDSCs的比例明显增名：肿瘤诱导的MDSCs累积常常归因干其成熟分化的受阻,所以我们进一步对分离纯化的MDSCs进行体外诱导培养,流式检测结果显示CUL4B缺失的MDSCs向成熟的巨噬细胞以及树突细胞分化的能力明显减弱。综合看来,CUL4B的缺失通过促进造血祖细胞向MDSCs的分化以及阻碍MDSCs的成熟分化两方面机制造成了MDSCs的累积。第三部分CUL4B通过正向调控AKT/β-catenin信号通路抑制MDSCs的累积与活化以上结果提示我们CUL4B既可以调控MDSCs的累积也可以影响其活性,那么这中间的机制又是怎样的呢,我们进行了以下分析：1. CUL4B通过调控GSK3P介导的β-catenin降解抑制MDSCs的累积：有报道显示β-catenin在MDSCs的累积与免疫抑制功能中发挥重要作用。为探究CUL4B调控MDSCs的累积和活化过程是否依赖β-catenin,我们对β-catenin的蛋白水平进行了检测,结果显示CUL4B缺失后MDSCs胞内伴随着GSK3β活性升高p-catenin的降解增多,从而导致β-catenin蛋白水平下降,而且这一降解增多的现象可以被GSK3β的抑制剂拯救；利用GSK3β的抑制剂分别对分离纯化后的Lin-造血祖细胞和MDSCs进行体外诱导处理,流式检测结果显示CUL4B缺失所导致的造血祖细胞向MDSCs分化增多以及MDSCs进一步成熟分化受阻的现象都有所改善；利用β-catenin持续表达的慢病毒分别感染分离纯化后的Lin-造血祖细胞和MDSCs后进行诱导分化实验,也得到了相同的结果；在体内,给小鼠腹腔注射LiCl后,Cul4b CKO小鼠外周血中CD11b+ Gr-1+细胞群的累积明显缓解,同时再对小鼠进行荷瘤实验,CUL4B缺失所引起的肿瘤生长加快的现象也得到明显拯救。因此,我们得出结论CUL4B通过上调β-catenin的表达负向调控MDSCs的累积与活化过程。2. CRL4B协同PRC2和HDACs转录抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表达从而促进AKT激酶的活性：为了进一步探究CUL4B调控GSK3β活性的机制,我们对野生以及敲除小鼠来源的MDSCs中β-GSK3β (Ser9)的激酶AKT的活性进行了检测,结果我们发现代表AKT活性的Thr308和Ser473两个位点的磷酸化水平在CUL4B缺失之后都有不同程度地降低,进一步研究发现这两个位点磷酸化水平的降低是它们对应的磷酸酶PP2A以及PHLPP1/2表达水平的升高引起的。通过ChIP实验,我们证实CRL4B、PRC2和HDACs复合物的主要成分共同结合于PP2A以及PHLPP1/2对应基因的启动子区域,q-ChIP结果显示在CUL4B低表达的RAW264.7细胞中H2AK119的单泛素化水平明显降低,PRC2的主要组分EZH2和HDACs在这几个磷酸酶基因启动子上的结合也明显减少,同时伴有它们的底物H3K27三甲基化水平的降低以及组蛋白的乙酰化水平的明显升高,说明CUL4B对这些磷酸酶基因具有明显的转录抑制作用。3. MDSCs的累积和活化与CUL4B/AKT/β-catenin信号通路呈负相关性：上述实验显示CUL4B缺失后引起的MDSCs中AKT/β-catennin信号通路的下调并且导致MDSCs的累积与活化,那么这种负调控关系在野生型MDSCs中是否也存在呢?我们分别在未免疫以及荷瘤小鼠来源的MDSCs中检测CUL4B、PHLPP1/2、 PP2A、AKT、GSK3β以及P-catenin的表达情况,结果显示在活化的MDSCs中,这些分子的表达水平与CUL4B缺失所导致的信号途径的改变结果一致,同时伴随着CUL4B表达的下调。与此相一致,癌症患者MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信号也呈现一个显著低于健康对照的状态,表明伴随着肿瘤进程的发展,CUL4B/AKT/β-catenin信号通路在MDSCs中表达普遍下调。综上,我们的研究发现：CUL4B可以限制免疫抑制肿瘤微环境的重要组分MDSCs的累积与活化,因而CUL4B的缺失促进了Cul4b CKO小鼠体内移植瘤生长速度的加快以及其机体免疫耐受能力的增强；机制上,CUL4B通过协同转录抑制复合物PRC2和HDACs抑制磷酸酶PP2A和PHLPP1/2的表达,进而促进AKT激酶的活性,下调GSK3β介导的β-catenin蛋白降解,从而负向调控MDSCs的异常累积；此外,相对比其它造血细胞,健康个体的MDSCs中CUL4B/AKT/β-catenin信号途径的表达下调,而这下调一现象在荷瘤小鼠和肿瘤患者中更为显著。因此,我们得出结论,虽然CUL4B在肿瘤细胞中发挥原癌基因的作用,但是在免疫抑制肿瘤微环境的形成中它却发挥负调控因子的作用,证实CUL4B在肿瘤发生发展中的双面性。
【图文】：

亲代,小鼠,策略,杂合子

图１小鼠亲代交配策略逡逑

子代,策略,或体,成分

４．小鼠基因型鉴定逡逑４．１主要试剂逡逑１）逦ｌ0ｘ蛋白酶Ｋ消化缓冲溶液：逡逑成分逦浓度或体积比逡逑Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ邋（ｐＨ８．３）逦１００邋ｍＭ逡逑ＫＣｌ逦５００邋ｍＭ逡逑Ｔｗｅｅｎ－２０逦１％逡逑２）蛋白酶Ｋ溶液；逡逑成分逦质量或体积逡逑蛋白酶Ｋ粉末逦１００邋ｍｇ逡逑灭菌Ｈ蒸水逦１０邋ｍｌ逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2

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