取代基对菌绿素类光敏剂的抗肿瘤活性影响的研究

发布时间：2020-01-24 06:36

【摘要】：本研究旨在探讨不同的取代基对全新合成的菌绿素光敏剂的抗肿瘤活性的影响。本研究分为两部分:第一部分主要运用定量构效关系探讨具有不同取代基12种菌绿素化合物的化合物结构与光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)杀伤肿瘤细胞效果的联系。不同极性的取代基对菌绿素光敏剂PDT杀伤肿瘤细胞的效果和亚细胞定位的具有不同的影响,为新型菌绿素光敏剂的开发提供重要线索。第二部分主要探讨二氰基取代基、不同的中心金属离子以及药物传递系统对合成菌绿素在体内和体外的PDT作用效果的影响。二氰基取代基增强了菌绿素作为光敏剂活性和光稳定性,而聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)胶束被用作药物递送系统,可以光敏剂减少聚集和增加PDT活性。第一部分:菌绿素PDT效果的定量构效关系(QSAR)的研究。本研究是第一次将定量构效关系应用于合成的菌绿素光敏剂的活性研究。第一章研究了12种新合成光敏剂的吸收光谱、极性、细胞摄取量与细胞杀伤效果的定量构效关系,并用激光共聚焦显微镜观察菌绿素光敏剂在宫颈癌细胞Hela中的亚细胞定位情况。1.用紫外分光光度法测定菌绿素BC1-12的吸收光谱,结果表明菌绿素的吸收峰在730-780 nm之间。2.通过在搅拌法实验获得12种光敏剂在辛醇与水的分配系数(m Log P)值,在菌绿素结构的基础上通过软件计算出理论分配系数(clog P值)。测得的分配系数(m Log P)值是-0.5-2.5之间。结果表明,12个菌绿素极性是具有多样性的,包括亲脂性(3个化合物),两亲性(4个化合物)和极性(5个化合物)。3.用荧光分光光度法测定菌绿素BC1-12在人宫颈癌细胞Hela中的吸收量。结果表明在给药浓度为20μM时,Hela细胞对菌绿素BC1-12的药物吸收量均在0.1-0.4μM/L 104 cells范围内。4.用MTT法检测化合物BC1-12对肿瘤细胞的PDT杀伤作用,而在光照条件下10J/cm2对体外培养的宫颈癌Hela细胞的半数致死量LD50来衡量PDT的杀细胞活性。结果表明化合物BC1-12在0.25-1μM剂量范围内的暗毒性较小。最活跃的化合物具有100n M或更低的LD50值(BC3,12,4,6,2)。具有中间活动的化合物具有100n M至1μM的之间的LD50值(BC11,1,10,9)。活性较低的化合物LD 50值大于1μM(BC5,7,8)。5.用激光共聚焦显微镜观察三种不同不同结构特征及不同Log P值的菌绿素(BC4,6,8)在Hela人宫颈癌细胞中的定位情况。结果显示亲脂性较高的BC4定位于粗面内质网和线粒体,中度亲脂性BC6主要主要定位在溶酶体,和低亲脂性的BC8主要定位于溶酶体。6.建立数学模型,采用理论脂水分布系数(c Log P)和测量脂水分布系数m Log P作为结构参数,采用每单位摄入半数致死量LD50作为PDT活性参数作为PDT活性参数,推算菌绿素结构与PDT活性的定量构效关系(QSAR),得到PDT细胞毒性与测量脂水分布系数m Log P相关性(R2=0.94)显著高于比理论脂水分布系数c Log P相关性(R2=0.61)。结论:定量构效关系的结果表明光敏剂取代基的极性与光敏剂的杀细胞效果具有高度相关性,两亲性的菌绿素光敏剂具有最大的光动力活性,可能是由于两亲性菌绿素光敏剂更倾向于在膜脂质双层含量高的线粒体和内质网定位。在这些关键细胞器中产生PDT作用诱导的损伤是最有可能触发细胞死亡。第二部分(第二、三、四章):评价二氰基、中心金属离子(氢、锌、钯)以及聚氧乙烯蓖麻油胶束介导的药物转递系统对合成菌绿素的PDT活性的影响作用第二章首先研究四个新合成菌绿素母体菌绿素(BC)、二氰基菌绿素(NC)2BC、二氰基锌菌绿素(NC)2BC-Zn和二氰基钯菌绿素(NC)2BC-Pd的光化学特性,探讨了二氰基以及金属离子对菌绿素光敏剂光漂白和PDT活性的影响。第三章研究纳米胶束药物载体(Cremophor?EL,CREL)包封对于提高菌绿素光敏剂的水溶性和PDT活性的作用的影响,以及比较游离菌绿素和胶束封包菌绿素介导的PDT对人宫颈癌细胞的体外杀伤作用。第四章测试了活性最佳二氰基钯菌绿素(NC)2BC-Pd的胶束制剂在异位人宫颈癌小鼠模型的抗肿瘤作用,对新型光敏剂的研发以及纳米胶束药物载体应用于临床提供实验依据提供实验依据。1.紫外可见分光光度法被用来研究比较4个新菌绿素光敏剂吸收光谱和自聚集现象。结果表明:所有4个新菌绿素化合物之间740 nm至765nm的吸收峰在近红外范围。4个新菌绿素在培养基中都产生了自聚集现象,带金属离子的(NC)2BC-Zn和(NC)2BC-Pd自聚集现象较低。2.紫外分光光度计测量菌绿素光敏剂的光谱,通过在不同光照剂量下光谱的峰值变化探讨光敏剂的光稳定性(光漂白)。结果表明,(NC)2BC和(NC)2BC-Pd比BC更稳定,不易发生光漂白,二氰基和钯金属的添加增加了吡咯环的光稳定性。3.使用单态氧和羟基自由基荧光探针测量活性氧的产量及类型,活性氧产量的顺序为(NC)2BC-Pd(NC)2BC-Zn(NC)2BCBC。然而只有(NC)2BC-Pd和(NC)2BC发生I型光化学反应,产生了羟基自由基,激活羟基自由基荧光探针HPF。4.薄膜水合方法制备的Cremophor胶束药物递送系统。纳米胶束的储存浓度约为500μM。5.采用紫外可见光分光度计测量各个化合物的细胞摄取量。菌绿素BC和(NC)2BC-Pd具有最高细胞摄取量,其次是(NC)2BC和(NC)2BC-Zn。使用纳米胶束封包技术降低了(NC)2BC-Pd和BC的摄取,但对(NC)2BC和(NC)2BC-Zn的摄取没有明显的影响。6.在10J/cm2的近红外光照能量下,MTT测量各个菌绿素对于人宫颈癌细胞的PDT活性(根据半数致死量LD50值)。PDT活性最高的化合物是(NC)2BC-Pd,LD50值为25 n M。(NC)2BC的活性居中,LD50值为60n M,而其中最不活跃的化合物是BC和(NC)2BC-Zn,它们的LD50值≥1μM。胶束封包都显著降低了光敏剂PDT作用的孵育时间,而且提高了4个光敏剂杀伤肿瘤细胞的PDT活性。活性较低BC的胶束封包制剂PDT活性提高了5倍,LD50浓度由1.8μM降至为350 n M。原本活性很强的(NC)2BC-Pd及(NC)2BC只显示了不到3倍的改进。7.共聚焦显微镜来测定BC,(NC)2BC和(NC)2BC-Zn及其纳米胶束制剂的亚细胞定位情况。标记溶酶体的吖啶橙和标记线粒体的罗丹明123被用来确定所造成的PDT与(NC)2BC钯使用直接稀释或纳米胶束递送的细胞内损伤的位置。胶束作为药物递送系统可改变菌绿素光敏剂在亚细胞器的分布。8.严重联合免疫缺陷(SCID)的BALB/c小鼠的人宫颈癌异种移植物模型来评价(NC)2BC-Pd-CREL介导的PDT疗效。荷瘤小鼠接受(NC)2BCPd-CREL尾静脉注射1毫克/千克体重的剂量。9.使用Hochest33342血管灌注染色研究PDT治疗后1小时,肿瘤血管灌注变化情况。与对照相比,(NC)2BC-Pd-CREL介导的PDT导致肿瘤的血管灌注的显著下降。10.荷瘤重度免疫缺陷小鼠尾静脉给予(NC)2BC-Pd-CREL注射后进行PDT处理。结果表明PDT治疗显著抑制了移植瘤的生长。结论:取代基团二氰基提高了菌绿素光敏剂的光稳定性以及光活性,中心金属离子降低了光敏剂自聚集现象。金属离子钯的添加促使光化学反应转为I型光化学反应,PDT活性得到极大的提高。本研究还发现菌绿素的亚细胞定位情况影响菌绿素PDT活性,定位在线粒体及内质网的光敏剂具有更强的PDT活性。聚氧乙烯蓖麻油纳米胶束载体的应用不仅提高了光敏剂在水溶液中的溶解度,降低光敏剂自聚集现象,有效提高光敏剂的PDT活性。(NC)2BC-Pd-CREL介导的PDT治疗在裸鼠宫颈癌异种移植瘤的增殖有明显的抑制作用,PDT破坏肿瘤的血管灌注。
【图文】：

化学结构,图谱,二氢卟酚,卟啉

卟啉，二氢卟酚和菌绿素的化学结构和吸收图谱

小牛血清,甲醇,吸收光谱,培养基

2.3.1 二氰基菌绿素的光谱菌绿素溶于甲醇的光谱显示，4 个菌绿素在近红外波段 730-760 nm 都较高的吸收峰。结果表明，中心重原子金属的插入后，，由于增强了菌绿素环的平面性，从而使菌绿素的 B 带和 Q 带吸收有所增加，荧光量子产率很大的提高，又由于金属原子产生的重原子效应使得菌绿素荧光寿命变短从而导致辐射跃迁几率大大提高；吸电子取代基二氰基的添加，进一步抑了菌绿素环中 π 电子的离域。取代基二氰基也增加了分子的共面性，使得光量子产率略有增加，荧光寿命变长。中心插入金属原子和周边取代基二基均减小了菌绿素环电子密度，导致 HOMO 与 LUMO 之间的能量差升高从而使荧光峰蓝移。进一步的超快瞬态吸收光谱研究将为理解和掌握菌绿及其衍生物的荧光性能提供更有力的依据。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5

【相似文献】