组蛋白去乙酰化酶HDAC1在胃癌中的表观遗传调控及其作用机制的研究

发布时间：2020-01-25 14:35

【摘要】：背景：胃癌(Gastric Cancer,GC)是四大最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。在胃癌的发生发展过程中及治疗过程中有许多表观遗传学改变,可导致细胞生长、增殖、分化、凋亡等信号通路的异常以及影响对肿瘤的进一步治疗。组蛋白去乙酰化酶HDAC1在表观遗传调控网络中有重要作用,并且在多种恶性肿瘤中表达增高,但其在胃癌中怎样影响细胞凋亡以及细胞对化疗药物的反应仍有待进一步研究。目的：第一部分研究：已有研究表明阿霉素与HDAC抑制剂联用具有协同作用,但其相互作用的分子机制尚未明确。本实验意在明确胃癌中HDAC1在阿霉素作用下受表观遗传网络调控的分子机制以及HDAC1在阿霉素抗肿瘤过程中发挥生物学作用的分子机制。第二部分研究：已有研究表明在胃癌中HDAC1表达增高,但]SDAC1在胃癌恶化过程中发挥作用的分子机制尚未明确。本实验意在探索HDAC1作为表观遗传网络调控分子抑制胃癌细胞凋亡的分子机制以及HDAC抑制剂(HDACi)促进胃癌细胞凋亡的表观遗传学机制。两部分研究试图分别从HDAC1对化疗药物作用下的胃癌细胞的影响及HDAC1对胃癌细胞自发凋亡的影响两个方面综合阐释HDAC1促进胃癌的发生发展与耐药的表观遗传学分子机制。方法：第一部分研究：首先通过western blot检测了胃癌细胞在接受阿霉素处理后HDAC1蛋白表达量的变化。进一步通过软件筛选及RT-qPCR方法找出在阿霉素处理后影响HDAC1表达的microRNA,并从功能与结构两方面验证该microRNA对HDAC1的调控。MTS细胞存活实验证实HDAC1对阿霉素敏感性的影响。最后用流式细胞术验证HDAC1对阿霉素损伤DNA作用的影响。第二部分研究：首先通过western blot及流式细胞术检测HDAC抑制剂曲古霉素A(TSA)处理后胃癌中caspase2凋亡信号通路的激活。RT-PCR及western blot检测TSA处理后CRADD的表达,进一步用流式细胞术验证CRADD在TSA诱导的胃癌细胞凋亡中的作用。免疫组化染色分析胃癌中CRADD的表达。接下来运用克隆形成实验等确认CRADD对胃癌的生长抑制作用。最后应用染色质免疫共沉淀ChIP实验等证明在胃癌中HDAC1可以直接调控CRADD的转录。结果：第一部分研究揭示了胃癌中HDAC1在阿霉素作用下的表观遗传学调控机制以及其在阿霉素抗肿瘤作用中的影响。我们发现阿霉素通过增高miR-520h的表达,miR-520h靶向I HDAC1 3'UTR,继而特异性地下调HDAC1蛋白的表达,进而使得染色质疏松,促进了阿霉素嵌入DNA结构中,加剧了阿霉素诱导的DNA损伤作用,最终进一步杀伤胃癌细胞。第二部分研究阐述了胃癌中HDAC1调控凋亡信号通路的表观遗传学机制及功能。我们发现在胃癌中HDAC1通过促进CRADD的转录表达,最终激活Caspase 2并促进Caspase 2依赖的细胞凋亡。结论：本篇论文从多角度多方向阐释了组蛋白去乙酰化酶HDAC1在胃癌发生发展中的表观遗传学调控机制与功能,为HDAC抑制剂治疗肿瘤提供了新的表观遗传学理论基础。
【图文】：

阿霉素,胃癌细胞,蛋白

用ＭＴＳ细胞存活实验明确了阿霉素的化巧效应，发现其的确可１＾NB杀伤胃癌细胞系逡逑ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８，并且杀圼作用呈浓度及时间依赖性，在４山ＶＩ浓度的阿霉素作逡逑用７２小时后，胃癌细胞的存活率化于１０％（图１Ａ和化）。接下来通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑检测了胃癌细胞在接受阿霉素处理后ＨＤＡＣＩ类家族的几种蛋白表达量的变化，有逡逑意思的是，我们发现ＨＤＡＣ１蛋白有明显下调，而同家族的ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、逡逑ＨＤＡＣ８却没有明显变化（图１Ｃ），这提示着胃癌中阿霉素可能引起特异性的逡逑ＨＤＡＣ１蛋白表达下调？进一步的研究发现４ｎＭ的阿霉素最早引起ＨＤＡＣ１蛋白下逡逑调开始的时间是在处理后第４－６小时（图１Ｄ），考an到这一时间明显短于一般蛋白逡逑质降解所需要的时间，所Ｗ提示ＨＤＡＣ１蛋白的下调可能不是由于阿霉素促进其蛋逡逑白质降解所引起的。逡逑４０逡逑

序列,阿霉素,胃癌细胞

ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ，邋ｍｉＲ－５８４，邋ｍｉＲ－＾Ｏｇ，邋ｍｉＲ－５１９ｃ－５ｐ，ｍｉＲ－５１２－５ｐ，邋ｍｉＲ－５１１，ｍｉＲ－＂０，逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ。运用ＲＴ－ｑＰＣＲ检测后发现，在这些ｍｉｃｒｏＲＮＡ中只有ｍｉＲ－５２０ｈ在阿霉逡逑素处理后有明显上调（图３Ａ），因此我们进一步重点研究胃癌中阿霉素处理后逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ与胜）ＡＣ１的关系。首先，通过ＲＴ－ｑＰＣＲ在ＭＫＮ４５和ＭＫＮ２８细胞中逡逑再次分别验证ｍｉＲ－５２０ｈ可被阿霉秦上调表达量（图犯）。然后通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑栓测发现用５０邋ｎＭ浓度的ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ抑制ｍｉ民－５２０ｈ后可Ｗ逆转ＭＫＮ４５和逡逑ＭＫＮ２８细胞中阿霉素诱导的ＨＤＡＣ１蛋白下调（图３Ｃ），，并且在这当细胞系中用逡逑１０邋ｎＭ邋或邋２０邋ｎＭ邋浓度的邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋ｍｉｍｉｃｓ邋模拟巧源性邋ｍｉＲ－５２０ｈ邋可ＬNB下调邋ＨＤＡＣ１逡逑蛋白的表达量（图３Ｄ），这些结果提示阿霉素通过上调ｍｉＲ－５２０ｈ来下调ＨＤＡＣ１逡逑的表达。逡逑接下来运用双巧光素酶报告系统进一步从结构上证明ＨＤＡＣ１的确是逡逑ｍｉＲ－５２０ｈ的目标基因之一。双巧光素酶报告载体表达后自身发出巧光，可被巧光逡逑酶标仪检测并相对定量。运用分子克隆技术将包含ｍｉＲ－５２化粗向结合序列的逡逑ＨＤＡＣ１邋３’－Ｕｒｍ序列克隆入双巧光素酶报告载体ｐＭＩＲ－ＲＥＰＯＲＴ邋Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ质粒；逡逑同时再构建另一个类似的突变型质粒，仅将ｍｉＲ－５２０ｈ乾向结合序列关键位置＂种逡逑子序列＂的关键碱基做点突变（图３Ｅ
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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