RIP1泛素化在亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用及其调控机制研究

发布时间：2020-01-27 19:19

【摘要】：结直肠癌是严重威胁人类生存消化道恶性肿瘤,在我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势,而结直肠癌五年生存率仍较低,因此开发有效的化疗药物具有重要意义。亚硒酸钠可以导致癌细胞周期阻滞,可有效诱导白血病、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞凋亡,可有效治疗结直肠癌、前列腺癌等异位移植瘤裸鼠,辅助治疗非霍奇金淋巴瘤病人可显著增强化疗疗效,但具体分子机制仍不清楚。本课题对亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡的分子机制进行了研究,提供了潜在的联合治疗靶点,揭示了RIP1泛素化在结直肠癌细胞凋亡诱导中的作用及调控机制,建立了结直肠癌异位移植瘤裸鼠模型,评估了亚硒酸钠的毒性及治疗效果并通过免疫组织化学等方法在肿瘤组织验证了细胞学水平上的发现。本研究选用结直肠癌HCT116及SW480细胞和亚硒酸钠为研究对象,对RIP1泛素化在亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡的作用及调控机制进行了研究。通过免疫共沉淀实验及免疫荧光实验发现亚硒酸钠诱导RIP1上Lys63(赖氨酸63型)多聚泛素链被移除,使得RIP1与Caspase8、FADD形成复合物激活Caspase8 。同时我们通过免疫荧光与Western blot实验发现,亚硒酸钠通过对RIP1上Lys63型多聚泛素链修饰的调节导致IKK/NFκB通路失活,从而下调了Caspase8的抑制蛋白Flip,进一步促进了Caspase8的激活。通过免疫荧光及Western blot实验对下游通路进行研究发现亚硒酸钠诱导Caspase8激活在早期凋亡中除直接起始外源凋亡通路外,Caspase8通过切割Bcl-2家族蛋白Bid,导致tBid从细胞质基质转位至线粒体,从而诱导线粒体内源凋亡通路。本研究采用RIP1抗体进行免疫共沉淀后孵育Lys63型多聚泛素链抗体率先对位于细胞质基质中RIP1的泛素化修饰水平进行了研究,且发现RIP1上Lys63型多聚泛素链修饰具有对泛素蛋白修饰的数目选择偏好。此外,本研究结果提示化疗药物诱导的凋亡可能与死亡配体受体起始的外源凋亡通路有类似途径,为化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡机理研究提供新的思路。进一步研究揭示了亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡中RIP1上Lys63型多聚泛素链修饰的调控机制。Western blot结果显示亚硒酸钠作用后泛素连接酶cIAP1及cIAP2明显下调而去泛素化蛋白酶CYLD显著上调。过表达cIAP1后进行免疫共沉淀实验发现RIP1上Lys63型多聚泛素链修饰水平明显上调,从而下调硒诱导RIP1与Caspase8、FADD形成复合物水平,Western blot及流式细胞仪检测到过表达cIAP1降低了亚硒酸钠诱导的凋亡。而另一方面,干扰cIAP1及cIAP2或过表达CYLD则显著下调RIP1上Lys63型多聚泛素链修饰,促进RIP1与Caspase8、FADD形成复合物,上调亚硒酸钠诱导的凋亡。此外,我们通过染色质免疫共沉淀实验(ChIP)揭示了亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞中LEF1上调CYLD表达水平的机制,首次发现在结直肠癌细胞中LEF1对CYLD的转录抑制作用,及亚硒酸钠诱导LEF1对CYLD的转录抑制的解除。本研究在细胞学水平的基础上,建立了HCT116异位移植瘤裸鼠模型,发现1mg/kg/d及2mg/kg/d的亚硒酸钠对HCT116异位移植瘤小鼠有良好的治疗效果而无明显毒副性。采用裸鼠肿瘤组织通过免疫组织化学和Western blot实验方法验证了细胞学水平的结果,发现2mg/kg/d的亚硒酸钠通过cIAP、CYLD通路激活Caspase8诱导裸鼠鼠肿瘤组织细胞凋亡,得到与细胞学水平上一致的实验结果。本研究课题首次揭示了Lys63型多聚泛素链在亚硒酸钠诱导结直肠癌细胞凋亡中的作用及调控机制。为亚硒酸钠治疗结直肠癌的临床应用提供了理论基础。
【图文】：

＂Ｖ￣＾ＯＯＨ逡逑图２亚砸酸盐吸收及代谢示意图２－１９逡逑Ｆｉｇ２邋Ｍｏｄｅｌ邋ｆｏｒ邋ｓｅｌｅｎＵｅ邋ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍｅ化ｈｏｌｉｓｍ．逡逑除了能有效诱导多种肿瘤细胞调亡，，亚砸酸钢还被报道能有效治疗前列腺癌、逡逑．逦结直肠癌等多种癌症的异位移植瘤小鼠。研究表明亚砸酸钢比其他有机晒补充剂具逡逑有更好的治疗ＰＣ３前列腺癌原位移植瘤的效果，服用亚砸酸钢能显著的减少原位肿逡逑瘤生长及向腹膜后淋己结的转移２２。研究还发现亚砸酸钢能增强顺巧治疗小鼠卵巢逡逑癌异位移植瘤的效果２３。此外，有为期五年的研究对严重缺砸地区的人群给予口服逡逑１５ｐｐｍ亚砸酸钢，发现原发性肝癌降低４３％２４。认为亚砸酸钢选择性杀伤癌细胞的逡逑原因可能是癌基因异常激活的细胞更容易在活性氧等的诱导下启发程序性细胞死逡逑ｔ而正常的细胞仅生长分裂受到影响。逡逑２．结直肠癌逡逑结直肠癌多发于直肠和乙状结肠，是严重威胁人类生存的消化道恶性肿瘤，在逡逑５０岁Ｗ上人群中发病率显著上升。２０１４年全球约７００．０００患者死于结直肠癌，致死逡逑率跃居第二，结直肠癌患者的五年生存率仅约４０％２５。结直肠癌在发达国家高发，但逡逑随着生活水平的提高及饮食习惯的改变

计结果显示，２０１１年我国结直肠癌发病率居所有癌症发病率第四位，结直肠癌死亡逡逑率在所有癌症死亡率第五位，而男性比女性高发，城市居民比农村居民高发，随年逡逑龄增长发病率显著上升（图３）邋２６。逡逑８逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34


本文编号：2573729