泛素结合蛋白Vx3募集肿瘤细胞泛素化蛋白及其诱导抗肿瘤免疫应答的实验研究

发布时间：2020-01-29 22:53

【摘要】：背景：我们以往研究证实：来源于肿瘤细胞、富含短寿蛋白的自噬小体—DRibbles疫苗能够诱导具有抗肿瘤效应的免疫应答,其中,树突细胞交叉提呈DRibbles中所包含的泛素化蛋白是其主要免疫学机制。在本研究中,我们拟从肿瘤细胞中直接提取泛素化蛋白并探讨其作为一种新型肿瘤疫苗的可行性。方法：1.募集泛素化蛋白：采用万科预处理肿瘤细胞EL4和B16-F10,得到细胞裂解液后用两种不同的泛素结合蛋白TUBEs (tandem ubiquitin binding entities)和Vx3(A7)蛋白募集肿瘤细胞的泛素蛋白。SDS-PAGE和western blotting检测获取的泛素化蛋白。2.泛素化蛋白诱导肿瘤特异性免疫应答的检测：应用不同剂量的泛素蛋白通过淋巴结或皮下免疫C56BL/6小鼠,并以DRibbles、去除泛素化蛋白的肿瘤细胞裂解液和完整的肿瘤细胞裂解液作为对照。收获免疫小鼠的脾脏细胞,体外用灭活的肿瘤细胞再刺激,ELISA方法测定培养上清中的IFN-γ,并用胞内染色测定细胞内IFN-γ。3.泛素化蛋白诱导抗肿瘤作用的检测：在C57BL/6小鼠中建立EL4和B16-F10二种肿瘤模型,通过淋巴结或皮下注射泛素蛋白,PBS,Vx3(A7)蛋白,完整的细胞裂解液和去除Ub蛋白的细胞裂解液,检测上述不同免疫在同源或异源肿瘤模型中的抗肿瘤效果,观察不同组肿瘤模型中肿瘤的生长状况。结果：1.结果显示：相比于TUBEs, Vx3(A7)蛋白能够从肿瘤细胞裂解液中募集更多的泛素化蛋白。用Vx3蛋白能够有效的从细胞裂解液中分离K63蛋白。基于这些结果,Vx3蛋白被用于纯化泛素化蛋白,并检测他们是否能够诱导特异性抗肿瘤免疫应答及其抗肿瘤作用。2.结果显示,从泛素化蛋白免疫后的小鼠中分离的淋巴细胞经灭活的肿瘤细胞刺激后能够以剂量依赖的方式分泌IFN-γ。初次免疫采用淋巴结注射相比于皮下注射能偶诱导更高的IFN-γ量。泛素化蛋白组IFN-γ的分泌量明显高于完整的细胞裂解液和去除泛素化蛋白的细胞裂解液。更有趣的是,当用从EL4或B16-F10细胞募集的泛素化蛋白免疫小鼠并分离淋巴细胞,用灭活的B16-F10或EL4细胞刺激也能够产生高水平的IFN-γ。3.抗肿瘤实验显示：泛素化蛋白与去除Ub蛋白的细胞裂解液和肿瘤细胞裂解液相比,经过三次免疫后诱导的免疫应答能够显著抑制荷瘤小鼠(EL4或B16-F10肿瘤模型)的肿瘤生长。而且EL4或B16-F10细胞来源泛素化蛋白诱导的免疫应答对B16-F10或EL4细胞的生长有一定的交叉保护作用。结论：1.与TUBEs相比,Vx3蛋白能够更有效地,从封闭蛋白酶体降解途径的肿瘤细胞裂解液中募集泛素化蛋白。2.与肿瘤细胞裂解液和去除泛素化蛋白的裂解液相比,泛素化蛋白疫苗能诱导更强的肿瘤特异性免疫应答。3.泛素化蛋白疫苗对EL4或B16-F10肿瘤具有明显的治疗效果,并且在同种异体肿瘤中具有交叉保护作用。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.51
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本文编号：2574502