去泛素化酶抑制剂P5091引起食管鳞癌细胞凋亡的机制研究

发布时间：2020-01-30 16:27

【摘要】：蛋白质去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)介导的蛋白质泛素化的负向调节过程。泛素和去泛素化调节的动态平衡,影响或者调节细胞的生长、发育、信号转导、等许多细胞生理病理过程。去泛素化酶通过水解底物蛋白质上的泛素链调控蛋白的稳定性,其活性直接影响细胞内多种蛋白的周转率、活性、再生以及定位。P5091属于泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩类抑制剂,能高度特异性抑制USP7酶的活性,并且在多发性骨髓瘤的治疗中显示良好的抗肿瘤效果,对万珂、多柔比星等耐药的多发性骨髓瘤细胞也具有抑制作用。此外,P5091抑制结肠直肠癌细胞的增殖和诱导凋亡。然而,P5091在食管鳞癌中的作用及分子机制仍需进一步研究。本文主要通过体外实验来研究P5091在食管鳞癌中作用及机制,评价P5091对食管鳞癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用,进一步利用si RNA技术沉默靶基因的表达来反向验证P5091对食管鳞癌细胞的作用,阐明P5091在食管鳞癌细胞中作用的具体分子机制,为食管鳞癌治疗的新药开发提供理论基础,为今后P5091应用于临床食管鳞癌的治疗提供理论基础。方法1.USP7在食管鳞癌中的表达水平检测:取多株食管鳞癌细胞系和食管癌组织芯片进行USP7蛋白水平的检测,选取有代表性的细胞系为本实验所用细胞系:KYSE450、KYSE510、KYSE30。2.药物浓度筛选:通过ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测来计算在不同细胞系中P5091的IC50值,从而确定不同细胞系的实验药物浓度。3.平板克隆形成实验和细胞形态学图片分析:评价不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效应。4.细胞凋亡检测:用AnnexinV-FITC和PI染色检测不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影响。5.Caspasae-3的激活情况:用FITC-DEVD-FMK染色法检测Caspase-3激活情况;Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表达情况。6.P5091对抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影响:Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的变化,本实验中Noxa发生明显变化。7.P5091对Noxa m RNA水平的影响:用Q-PCR的实验方法测定P5091处理食管鳞癌细胞后不同时间点促凋亡蛋白Noxa的m RNA水平变化。8.Noxa在P5091诱导细胞凋亡中的作用:对Noxa基因沉默后通过流式细胞术来检测不同浓度P5091引起的食管鳞癌细胞凋亡率的变化。9.转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)上调Noxa:同时对Noxa和调节Noxa基因表达的上游调控分子ATF4进行基因沉默,通过流式细胞术检测不同浓度P5091引起的细胞凋亡率的变化。用Western blot的方法检测对Noxa、ATF4基因沉默后凋亡标志性蛋白c-PARP蛋白水平的变化。结果1.P5091抑制食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite实验、平板克隆以及形态学观察的实验结果显示,P5091可以明显抑制食管鳞癌细胞增殖,并且呈浓度依赖性。2.P5091诱导食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30发生凋亡流式细胞术检测结果表明不同浓度P5091引起食管鳞癌细胞发生明显的凋亡,总凋亡率随药物浓度增加而升高。同时Western blot实验结果表明:细胞凋亡标志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表达增加,并且随着药物浓度增加而增高。3.P5091通过促进促凋亡蛋白Noxa的表达来诱导食管鳞癌细胞的凋亡Western Blot结果显示,P5091处理后Noxa蛋白水平明显增高。Q-PCR结果显示:P5091处理后在不同的时间点食管鳞癌细胞中Noxa的m RNA水平均有明显升高。对食管鳞癌细胞进行Noxa基因沉默后,不同浓度P5091引起食管鳞癌细胞的总凋亡率与Noxa基因敲除前相比明显降低,且c-PARP蛋白水平也明显降低,提示Noxa可能是P5091作用的关键分子。4.P5091诱导食管鳞癌细胞发生内质网应激(ERS)Western blot结果显示P5091处理后ERS的标志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明显增高,提示P5091诱导食管鳞癌细胞发生ERS。5.P5091通过上调ATF4,进而引起Noxa积聚,最终诱导细胞凋亡Western blot结果显示P5091处理后ATF4和Noxa蛋白水平明显升高,且流式结果提示P5091诱导细胞凋亡。同时,Q-PCR结果提示P5091也上调了Noxa的m RNA水平。为了进一步探究Noxa是否是受ATF4调控,我们进行Noxa和ATF4的基因沉默实验。结果提示:RNA干扰沉默ATF4后,P5091引起的细胞凋亡率明显降低,c-PARP和Noxa蛋白水平明显降低,提示ATF4很可能是P5091引起食管鳞癌细胞凋亡中Noxa积聚的主要调节因子。结论1.P5091显著抑制食管鳞癌细胞的增殖。2.P5091通过ERS上调ATF4的表达,促进Noxa的表达,进而引起食管鳞癌细胞凋亡。
【图文】：

食管鳞癌,细胞,细胞系,免疫印迹

实验结果.实验结果.1USP7 在食管鳞癌细胞系及组织中的表达情况检测首先通过免疫印迹和免疫组化的实验方法检测食管鳞癌细胞和组织中U白表达水平，初步了解 USP7 在食管鳞癌中的表达情况，也为下一步实验所胞系的筛选提供依据。综合免疫印迹实验和免疫组化实验结果，初步表明食管鳞癌细胞系和癌组织中 USP7 呈普遍表达的情况（图 1）。此外，免疫实验结果我们可以看出，7 种食管鳞癌细胞系中 USP7 的表达水平并不一致可能与食管癌细胞的分化以程度、耐药等因素有关。因此，，本实验中，选SP7 不同表达水平的细胞系 KYSE30、KYSE510 和 KYSE450 来进行实验。

实验检测,增殖抑制,细胞,细胞活性

实验结果3.2 P5091 抑制食管鳞癌细胞增殖3.2.1ATPlite 实验：用不同浓度梯度 P5091 分别处理三种食管鳞癌细胞 72h，通过 ATPlite 实验检测细胞活力，判断 P5091 对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用。结果显示，在相同的处理时间条件下，随着 P5091 浓度的增高，细胞活力降低，即 P5091 对食管鳞癌细胞的增殖抑制作用随之也增加(与 DMSO 对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)，且呈剂量的依赖性。（图 2）
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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