紫草素对A549细胞抑制作用及阿霉素肿瘤抑制效应影响的机制探讨

发布时间：2020-01-31 15:52

【摘要】：研究背景新近的流行病学资料表明,肺癌已经成为恶性肿瘤的首位,严重危害人类的健康。其中80-85%为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),包括腺癌、鳞癌、大细胞癌等。尽管肺癌的治疗手段不断进步,肺癌的生存率仍然很低。化疗、放疗仍是目前治疗这些患者的常用手段。肿瘤耐药是当前化疗的一个主要问题,其中涉及许多因素,包括抗癌药物的效力、肿瘤细胞对药物反应、肿瘤细胞微环境、肿瘤细胞的异质性等。因此,寻找高效低毒的抗癌药物成为近年来肿瘤基础和临床研究的热点。在NSCLC患者治疗中,阿霉素作为一种治疗药物,在一些难治性病例中曾被选用。然而,随着现代医学的发展,新型化疗药物的研制,在肺癌的治疗方面,阿霉素逐渐被遗忘。同时,由于两方面的因素限制了阿霉素的临床应用,一方面由于其骨髓抑制、心肌损伤和心肌毒性等毒副作用;另一方面,阿霉素的耐药性是一个重要的因素。正如许多传统抗癌药物一样,如何克服阿霉素的毒副作用和耐药性是临床学者需要迫切解决的难题。关于阿霉素的研究也从未终止。近年来,中草药的抗癌作用越来越引起人们的关注。中草药是祖国医学防治疾病的有力武器,人们发现中药治疗恶性肿瘤,在提高化疗效果、改善生存质量、减轻临床症状等方面都有很好的效果。已有研究证实,部分中药与传统化疗药物联合应用表现出独特的优势,能够有效缓解晚期NSCLC患者症状,减少不良反应,改善病人生活质量。紫草素是从中药紫草的根部提取得到的一种萘醌类化合物,研究发现,其对肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞均有抑制作用。关于紫草素在NSCLC方面的抗癌作用及其涉及的具体机制尚未完全阐明。目的观察紫草素对A549细胞的增殖抑制作用以及与阿霉素联用后对A549细胞凋亡、细胞周期、侵袭、迁移的影响。探讨紫草素联合阿霉素对肺癌A549细胞抗肿瘤作用的机制。方法1.噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测不同药物处理的肺癌A549细胞抑制率。2.Transwell法检测A549细胞侵袭数。3.细胞划痕实验检测A549细胞迁移率。4.集落克隆法检测A549细胞的增殖。5.PI染色检测细胞凋亡。6.流式细胞仪检测细胞周期。7.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达。8.二甲基亚砜(Dihydroethidium,DHE)荧光探针检测药物对A549细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影响。9.腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)检测试剂盒检测细胞内ATP水平变化。10.荧光显微镜下观察线粒体膜势能变化。11.流式细胞仪测定A549细胞内阿霉素浓度。12.活细胞工作站观察细胞内阿霉素荧光强度。13.Westem-blot检测ABC转运相关蛋白的表达。结果1.0.8μmol/L以上浓度的紫草素对A549细胞显示出较强的抑制作用,因此我们选择0.8μmol/L作为后续实验的药物起始浓度。2.0.8μmol/L以上浓度紫草素作用于A549细胞48h以后,细胞数量明显减少,细胞间距增大,胞体变圆、缩小,出现明显的细胞凋亡现象。3.与对照组比较,不同浓度紫草素处理组A549细胞侵袭数目、迁移率降低,存在统计学差异。与对照组及单用药物组相比,紫草素联合阿霉素组侵袭细胞数目、迁移率显著减低。与对照组比较,各组MMP-2、MMP-9表达水平均下调,其中紫草素与阿霉素联合组MMP-2、MMP-9表达水平最低。4.将不同浓度的紫草素、阿霉素分别处理A549细胞24h及48h,MTT结果显示紫草素和阿霉素均能以时间及剂量依赖性方式抑制肺癌A549细胞增殖,与对照组相比均具有统计学差异。而紫草素和阿霉素之间对肺癌A549细胞增殖的抑制无明显差异。用紫草素和阿霉素共同处理的A549细胞比单独应用紫草素或者阿霉素处理细胞显示出较少的活力,细胞存活率为53.77%,与对照组相比具有统计学差异。5.紫草素与阿霉素合用组对肺癌A549细胞的集落克隆形成率明显减少。6.紫草素与阿霉素联合用药能有效诱导肺癌A549细胞发生凋亡,其诱导的凋亡率明显高于对照组、紫草素组、阿霉素组,差异有统计学差异。7.紫草素联合阿霉素组较阿霉素组S期细胞百分数增加,G0/G1期细胞百分数减少,两药联合对细胞周期的影响最明显。8.紫草素能够诱导肺癌A549细胞内ROS的生成。9.经过不同药物处理后,各组A549细胞内ATP水平较对照组均有所降低,紫草素组与阿霉素组ATP下降率分别达到80%和81%,而紫草素与阿霉素联合处理组A549细胞ATP水平下降最明显,达到60%。10.紫草素和阿霉素联合处理组A549细胞内线粒体膜电位降低明显。11.经过不同的药物处理,流式细胞仪显示紫草素与阿霉素联合处理组,A549细胞内阿霉素浓度较对照组、阿霉素组均明显升高,提示紫草素能够显著增加A549细胞中阿霉素的水平。12.活细胞工作站显示在分别接受紫草素、阿霉素处理后,能明显提升A549细胞内阿霉素的荧光强度。13.Westem-blot显示:在空白对照组多药耐药蛋白1(multi-drug resistance protein1,MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)蛋白水平均有不同程度的表达。经过紫草素或者阿霉素处理以后,这些耐药蛋白的表达水平均较前下降,以紫草素和阿霉素联合处理组下降最为明显。结论1.不同浓度的紫草素对A549细胞增殖具有抑制作用;紫草素能够增强阿霉素抑制A549细胞增殖作用。2.不同浓度的紫草素能够诱导A549细胞发生凋亡现象;紫草素能够增强阿霉素诱导A549细胞发生凋亡。3.紫草素能够抑制A549细胞的侵袭和迁移作用;紫草素能够增强阿霉素抑制肺癌A549细胞的侵袭和迁移作用。紫草素增强阿霉素抑制肺癌A549细胞的侵袭、迁移能力可能与抑制MMP-2、MMP-9的表达有关。4.紫草素能够干扰肺癌A549细胞周期,诱导凋亡。5.紫草素能够增强阿霉素破坏A549细胞线粒体膜的势能,抑制ATP的产生,促进A549细胞内ROS水平升高。6.紫草素能够通过降低阿霉素外排,提高阿霉素在A549细胞中聚集浓度。7.紫草素能够增强阿霉素抑制ABC转运蛋白的表达水平。
【图文】：

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紫草素的分子结构

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图 2.紫草素对肺癌 A549 细胞的增殖抑制作用gure 2. Effect of shikonin inhibited the proliferation of lung cancer A549 cellsCompared with 0μmol/LSHK group, * P<0.05, ** P<0.01同药物处理组 A549 细胞镜下形态观察ol/L 以上浓度紫草素作用于 A549 细胞 48h 以后，出现明显的细为：细胞数量明显减少，，细胞间距增大，胞体缩小、变圆 (图
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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