MiRNA-146b-5p与甲状腺乳头状癌自噬的研究

发布时间：2020-02-06 04:46

【摘要】：背景MicroRNA是指一系列长度估计在19-25个核苷酸的非编码小分子RNA,在结构上具有高度保守性,在功能上MicroRNA通过与目标mRNA的3’末端非翻译区特异性结合【1】,进而引起目标MicroRNA的降解或者翻译抑制。另外,MicroRNA的结合区域现在被证实不仅仅限于3'-UTR,在基因的5'-UTR、编码区以及启动子均发现有MicroRNA结合序列,这提示,MicroRNA和基因是一对多的关系,即一种miRNA可以调控多达上百种的目的基因。也正是通过这种作用,MicroRNAA参与调控包括细胞增殖,分化,衰老,凋亡在内的多种细胞进程。甲状腺癌是人类最常见的内分泌系统恶性肿瘤,女性发病率明显高于男性,而且近年来,不管是在我国还是北美地区都成为发展速度最快的肿瘤之一【2】,而在甲状腺癌中,以甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)最为常见,几乎占到所有甲状腺癌的九成以上,而且通过规范的手术治疗和术后治疗,预后较好。自噬是细胞的一种在饥饿、能量代谢缺乏等应激状况下发生自我吞噬进而获取所需物质来维持细胞基本生命活动的过程,它表现在细胞浆中出现大量包裹着蛋白质(一般指长寿命蛋白,短寿命蛋白一般由蛋白酶体途径消化降解)和细胞器的双层膜性空泡结构和溶酶体,对空泡内成分的降解而转变成为机体所需要的能量物质【3】,通过降解胞内蛋白,实现细胞本身的代谢需要,完成细胞器的转化和更新,是维持细胞内环境稳定的重要调节方式之一,并广泛存在于生命进化的过程当中。细胞自噬与多种疾病的有着紧密的联系,而肿瘤则是最早被发现与自噬相关的疾病之一【4】。在本课题的前期研究中,通过应用高通量的Micro RNA芯片筛选出了不同分期的甲状腺乳头状癌组织和癌旁正常组织中具有差别性表达的Micro RNA时发现,microRNA-146b-5p在早期和中晚期甲状腺乳头状癌组织中均持续表达,而且其表达水平随着肿瘤分期的上升而有升高的趋势,这一证据提示该miRNA可能在甲状腺乳头状癌的发生、发展和转移过程中起着重要作用。在接下来的实验中证实,过表达的microRNA-146b-5p能够促进PTC细胞的增殖和侵袭能力。而本研究旨在通过对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞株使用慢病毒质粒稳定转染进而microRNA-146b-5p稳定过表达和低表达的细胞株,之后利用透射电镜,细胞免疫荧光技术,Western blot技术,探讨microRNA-146b-5p对TPC-1细胞株自噬的影响。目的本实验通过慢病毒质粒转获得了mir-146b-5p高表达株,结合前期实验得到的慢病毒侵染mir-146b-5p低表达株和空白TPC-1细胞株,旨在前期研究mir-146b-5p和TPC-1生物学行为关系的基础上进一步研究mir-146b-5p和TPC-1细胞自噬的关系,得出结论后,为下一步研究自噬对TPC-1细胞生物学行为的影响,以及mir-146b-5p是否通过影响自噬进而影响TPC-1的生物学行为打下理论基础。方法1.构建稳定转染的mir-146b-5p过表达和低表达TPC-1细胞单克隆:(1)构建mir-146b-5p过表达慢病毒质粒(2)将mir-146b-5p过表达的慢病毒质粒转染进入TPC-1细胞中,获取mir-146b-5p稳定过表达的细胞单克隆(3)由于前期实验已经取得microRNA-146b-5p低表达的TPC-1细胞株,故无需再进行转染实验2.研究microRNA-146b-5p对TPC-1细胞自噬的影响(1)分组:microRNA-146b-5p低表达组,TPC-1细胞组,miRNA-146b-5P过表达组(2)应用透射电镜观察各组细胞自噬小体的形成(3)应用细胞免疫荧光检测各组细胞中LC3蛋白点状聚集程度的变化(4)Western blot技术检测各组细胞自噬标记物LC3-II水平(5)Western blot技术检测自噬特异性底物p62/SQSTM1水平结果(1)透射电镜下观察microRNA-146b-5p上调组,正常组,下调组三组细胞的自噬情况,观察到三组自噬程度有差异且自噬数量:下调组正常组上调组。(P0.05)(2)Western blot技术检测各组细胞自噬标记物LC3-II/I水平有差异且从高到低依次是:microRNA-146b-5p下调组microRNA-146b-5p正常组microRNA-146b-5p上调组。(3)Western blot技术检测自噬特异性底物p62/SQSTM1水平有差异且从低到高依次是:microRNA-146b-5p下调组microRNA-146b-5p正常组microRNA-146b-5p上调组。(4)应用细胞免疫荧光检测各组细胞中LC3蛋白点状聚集程度的荧光定量大小有差异且由高到低依次是:microRNA-146b-5p下调组microRNA-146b-5p正常组microRNA-146b-5p上调组结论本实验通过透射电镜观察各组细胞自噬,Western blot技术检测各组细胞自噬标记物LC3和自噬特异性底物p62/SQSTM1,细胞免疫荧光检测各组细胞中LC3蛋白点状聚集程度,以上实验结果通过不同角度得出结论microRNA-146b-5能够抑制TPC-1细胞的自噬,但是通过何种通路和靶基因产生这种作用以及能否通过这种作用和TPC-1的其他生物学特性能否联系起来,尚待进一步研究。
【图文】：

图 2. miRNA-146b-5p 扩增曲线A1、A2 为 microRNA up 组的 miRNA-146b-5p 扩增曲线B1、B2 为 NC 组 miRNA-146b-5p 扩增曲线

34图 5. Western blot 技术检测各组细胞自噬标记物 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ的水平以及 LC3-Ⅱ/Ⅰ的相对表达量A microRNA-146b-5p 正常组B microRNA-146b-5p 上调组C microRNA-146b-5p 下调组
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R736.1

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本文编号：2576802