致癌剂1，2-二甲基肼诱导SD大鼠形成结肠异常隐窝灶时肠道菌群结构及代谢变化的研究

发布时间：2020-02-09 13:45

【摘要】：目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)为全球范围内高发癌症,其发病率排第三位,致死率第四位,而确诊时大多为结直肠癌晚期,严重影响患者的治疗效果和生存质量。所以为了人类的健康,强调结直肠癌的早期筛查与治疗。因此,探究在还未形成结直肠癌的癌前阶段是否已有相关生物学指标的改变,来预测结直肠癌的发生,具有重要意义。异常隐窝灶(aberrant crypt foci,ACF)已被证实是1,2-二甲基肼(DMH)诱导大鼠形成结直肠癌的一种癌前病变,且先于腺瘤发生,并遵循结直肠癌发展的腺瘤-腺癌途径。而最近几年研究发现肠道菌群结构与功能的改变与人体健康受损和疾病的发生发展有密切关系。因此我们探究致癌剂诱导SD大鼠在结肠内癌前病变ACF形成时,肠道菌群结构及代谢变化是否已有变化,而作为一生物学指标以筛查健康人群和具有结直肠癌发生潜能的患者。方法:1.样本收集:将42只4周龄SD大鼠适应1周后随机分为两组,实验组为30只,对照组为12只。实验组大鼠每周颈背部注射一次DMH,连续注射2周,同时对照组注射相应体积的空白缓冲液。于造模后每隔1周收集所有大鼠的血液(1 ml)及粪便样本(3~4粒,约1 g),并同时随机处死4只大鼠(实验组3只,对照组1只),直至造模后17周处死剩余全部大鼠。2.实验检测:⑴ACF的观察计数:处死大鼠后,游离全段结肠肠管,粘膜面用0.2%亚甲蓝染色,光学显微镜下观察结肠内acf数量的变化,以及行石蜡切片he染色观察acf中肠上皮细胞的异型性改变。⑵收集到的血液样本离心后(3000rpm,10min),行血清elisa检测il-6、il-8及tnf-α浓度。⑶粪便菌群检测:粪便dna提取试剂盒提取粪便样本中的dna,并对提取的dna的16srrnav4区行pcr扩增,扩增纯化后的产物于用illuminamiseq平台测序检测粪便菌群结构及代谢变化。菌群结构检测包括菌群alpha多样性和beta多样性分析,最终得出实验组和对照组中有显著变化的菌群;菌群代谢功能分析使用picrust软件,根据kegg数据库中微生物代谢功能的类别对样本进行检测。结果:1.随着致癌剂dmh造模后时间的延长,实验组大鼠acf数目逐渐增加。造模后第1周acf数为0,第3周acf数为4.7±1.5个,第5周34.3±6.0个,第7周67.7±11.5个,第9周68.3±12.7个,第11周100.7±33.3个,第13周为114.0±24.3个,第15周为117.0±14.5个,第17周为122.2±25.7个。第3周时每个acf的隐窝数由1、2个组成,第5周到第17周acf隐窝数增加为3~5个。从造模后第3周开始,石蜡切片he染色示acf中的肠上皮细胞伴有增生及异型性增生状态。2.在结直肠癌癌前病变的acf时期,随着dmh造模后时间的的延长,sd大鼠血清内促炎细胞因子il-6、il-8及tnf-α浓度随着造模后时间的延长逐渐增加。除造模后第1周外,余8个时间点所观察到的实验组il-6、il-8及tnf-α浓度均高于对照组(p0.05)。3.在结直肠癌的癌前病变acf期,由beta多样性分析显示,造模后第1周两组间细胞菌群结构无显著变化,造模后第5周、9周、13周及第17周均出现菌群结构的改变。随着DMH造模后时间的延长,两组间结构差异越来越大。使用Metastats统计学方法对同一时间两组样本分析,得到在造模后第9周实验组中拟杆菌属丰度增加(P=0.0 18);第17周实验组乳杆菌菌属丰度减少(P=0.004)。4.在结直肠癌癌前病变的ACF时期,PICRUSt软件分析菌群代谢功能变化结果为:造模后第1周、5周、9周、13周两组间菌群功能代谢无显著变化,造模后第17周实验组碳水化合物代谢功能下降,而氨基酸代谢功能上升。结论:1.致癌剂DMH诱导SD大鼠肠道内发生极早癌前病变ACF,尚未对其健康状态造成明显影响,肠道菌群就已经发生了显著改变。因此肠道菌群的结构变化和代谢功能改变可作为一项重要的生物学指标,用于预测结直肠癌的癌前病变。2.癌前病变ACF时期,致炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的升高,提示炎症可能参与结直肠癌早期癌前病变的形成。
【图文】：

腔口,红色,箭头,亚甲蓝

导形成的 ACF（红色箭头），显示 ACF 由两个腔口隐窝组成（亚甲蓝染色）。H induced ACF (red arrow), showed that ACF consistshyperchromatic crypts（methylene blue staining）.

中肠上皮细胞,肠上皮,中肠

- 24 -图 2 ACF 中肠上皮细胞的增生和异型性增生。A：正常肠上皮；B：造模后 5周，ACF 中肠上皮增生；C：造模后 9 周，，ACF 肠上皮异性增生。（HE×200）Figure2 Hyperplastic and dysplasia intestinal epithelial cells ofACF.A:Normalintestinal epithelium;B:the fifth week after the DMH injected, hyperplastic intestinalepithelial cells ofACF;C:the ninth week after the DMH injected, dysplasia intestinalepithelial cells ofACF.(HE×200)
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【相似文献】