CUL4A调控胃癌化疗药物耐药性的作用机制研究

发布时间：2020-02-19 14:53

【摘要】：目的:泛素化是一类重要的细胞内蛋白质翻译后修饰形式,其主要作用是特异性介导胞内关键蛋白通过蛋白酶体复合物的降解,同时也可通过非蛋白降解方式改变底物活性,从而在细胞信号转导、细胞周期调节及DNA损伤修复等一系列关键生物学过程中发挥重要作用。泛素连接酶E3(Ubiquitin ligase)在蛋白质的泛素化过程中起到关键作用,介导经泛素激活酶E1(Ubiquitin-activiting enzyme)活化的泛素从泛素结合酶E2(Ubiquitin-conjugating enzyme)上转移至底物特定修饰位点。不同的泛素连接酶E3识别不同的底物蛋白,这就决定了其泛素化修饰底物的特异性。RNIG-finger家族中的CUL4A亚组是E3连接酶家族的重要成员,它们参与在翻译后水平精确调节细胞周期、DNA修复以及细胞凋亡等过程中关键蛋白的降解及活性,参与多种恶性肿瘤的发生、发展过程。本项目旨在探讨CUL4A在胃癌中的表达情况及其与临床病理资料的相关性,并通细胞及分子生物学实验,进一步研究其在胃癌化疗耐药过程中的调控作用及分子机制。方法:1.提取34例天津医科大学肿瘤医院收治胃癌患者的癌组织和配对正常胃组织全蛋白和RNA,通过Western Blotting和q RT-PCR的方法检测CUL4A的蛋白和mRNA含量,另收集天津医科大学肿瘤医院2003年1月-2009年6月期间手术的167例胃癌患者的肿瘤组织标本,包括肿瘤组织和相应的正常胃上皮组织,进行下列研究:(1)制备胃癌组织芯片,对所有患者的临床病理特征进行详统计分析。(2)应用免疫组织化学染色(IHC)方法检测胃癌组织和正常胃上皮组织中CUL4A的表达情况。(3)分析CUL4A的表达与患者的临床病理学资料以及预后之间的关系。(4)对接受化学治疗的患者进行亚组分析。2.应用pLKO-Tet-On质粒,构建CUL4A四环素诱导敲降型质粒,通过酶切法和测序法验证构建效果。应用慢病毒质粒构建系统通过转染试剂LipofectamineTM3000转入293T细胞中包装病毒,合成具有四环素诱导沉默CUL4A基因能力的慢病毒颗粒,构建携带四环素诱导沉默CUL4A基因的胃癌细胞株模型。利用Western Blot检测成功构建的上细胞株模型中,经四环素诱导后CUL4A蛋白的表达情况。3.通过WST-8检测敲降CUL4A蛋白后胃癌细胞系对5-FU和顺铂的药敏结果。PI法检测细胞周期并用Western Blot检测CUL4A底物蛋白中细胞周期相关因子的蛋白水平。应用彗星试验检测敲降CUL4A水平后肿瘤细胞DNA修复能力的变化,同时Western Blot检测CUL4A已知和潜在底物中DNA损伤修复相关因子蛋白水平的变化情况。通过Co-IP和竞争性Ubiquitin Assay实验检测EME1为CUL4A潜在底物的可能性。同时检测CUL4A敲降后肿瘤细胞的生长、凋亡和运动侵袭能力。结果:1.CUL4A在胃癌组织中的表达情况:(1)CUL4A阳性细胞着色定位于细胞核及细胞质中;胃癌组织中CUL4A的表达水平显著高于配对的胃正常上皮组织(P0.001)。(2)肿瘤患者中CUL4A的相对低表达与患者肿瘤TNM分期、Lauren分型相关,是影响患者预后的独立危险因素。(3)亚组分析结果显示CUL4A的表达情况与患者化疗效果呈正相关,且是化疗患者不良预后的独立危险因素。2.CUL4A表达降低后,胃癌细胞对5-FU耐受性增强,检测细胞周期相关因子发现,CUL4A底物蛋白P21水平升高,进一步将P21敲降后胃癌细胞对5-FU的耐受性降低;同时CUL4A表达降低后,胃癌细胞对顺铂的耐受性增强,胃癌细胞通过增强DNA修复能力,提高了其对顺铂的耐受能力,检测DNA修复相关因子发现,EME1蛋白水平明显升高,且与CUL4A敲降时间正相关,其mRNA水平则无明显改变,Co-IP实验结果显示EME1与CUL4A及其衔接蛋白DDB1均存在直接相互作用,竞争性Ubiquitin Assay实验结果表明,随着功能缺陷性(35)CUL4A的增加,EME1泛素化水平逐渐降低。以上结果初步证实,在胃癌细胞中EME1是CUL4A的一个新底物。结论:1.胃癌组织中CUL4A相对低表达是患者预后不良的独立危险因素,且与患者化疗抵抗相关。2.在胃癌细胞中,CUL4A通过调控P21及EME1的蛋白水平,影响胃癌细胞的细胞周期及DNA损伤修复能力,从而增强胃癌细胞对化疗药物的耐受性。
【图文】：

胃癌组织与胃上皮组织中CUL4A蛋白及mRNA水平比较

图 1.1 胃癌组织与胃上皮组织中 CUL4A 蛋白及 mRNA 水平比较定量 PCR 方法检测组织中 CUL4A mRNA 水平，Western-blotting 方法检测组织中 CUL4A 蛋白含量。结果显示肿瘤组织中 CUL4A 含量明显高于正常胃上皮组织1.2.1.2 CUL4A 在胃癌组织中的表达另收集 167 对胃癌肿瘤组织与应的正常胃上皮组织进行 IHC 染色，结果显示 CUL4A 在正常胃上皮组织为低水平表达或不表达；而在相应的胃癌组织中85 例患者胃癌组织中 CUL4A 呈高表达，占 50.9%，82 例患者为低表达，，占 49.1%CUL4A 在胃癌组织中的表达水平明显高于在非肿瘤组织中的表达水平，差异有统计学意义（P<0.001）。（图 1.2）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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本文编号：2581050