Icotinib耐药非小细胞肺癌细胞株的建立及其基因组变异研究

发布时间：2020-03-13 19:23

【摘要】：目的:盐酸埃克替尼(icotinib)为我国常用且有效的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)。由于其靶向性和低毒副作用的特点,在临床上EGFR突变的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者的治疗中取得了显著的疗效。但大多数病人在用药9～15个月后会产生获得性耐药,这已成为临床中亟需解决的问题。很多研究表明EGFR-TKI耐药与基因的变异有关,主要包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)和拷贝数变化(copy number variation,CNV)。与进口的EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼相比,icotinib的分子结构和体内代谢途径不同,因此icotinib的耐药可能存在不同的耐药机制。本研究利用全外显子测序技术对亲本和icotinib耐药细胞基因组进行测序,寻找icotinib耐药相关的基因组变异,并对其耐药机制进行初步研究。方法:首先,我们选用具有EGFR-TKI敏感突变的NSCLC细胞株PC-9(EGFR 19外显子E746-A750缺失),在体外采用icotinib浓度梯度递增法诱导建立耐药细胞株PC-9/icotinib resistance(IR)。通过形态学观察、MTT实验、划痕实验、蛋白印迹(Western blot,WB)和免疫荧光对耐药细胞PC-9/IR进行鉴定。然后提取PC-9和PC-9/IR细胞基因组DNA进行全外显子测序,分析测序结果,找到差异的SNV,indel和CNV,并在DNA、mRNA、蛋白和细胞生物学水平对icotinib耐药相关的SNP和CNV进行验证。最后,为了验证得到的耐药相关CNV(钙蛋白酶7扩增)是否为icotinib耐药特异性的变化,我们选取了两株EGFR-TKI耐药细胞,A549(EGFR野生型,对EGFR-TKI原发性耐药)和H1975(具有EGFR-TKI继发性耐药突变EGFR T790M和敏感突变21外显子L858R),在体外大剂量icotinib进行诱导40周,在DNA、mRNA和蛋白水平对钙蛋白酶7(calpain-7,CAPN7)在诱导前后的细胞模型中进行验证,探讨icotinib的耐药机制。结果:经过40周的icotinib诱导得到耐药的NSCLC细胞PC-9/IR,与亲本细胞相比,耐药细胞PC-9/IR的形态由圆形变为梭形,在同一药物浓度下耐药细胞的细胞活力高与亲本,且PC-9/IR细胞的迁移速率,靶点蛋白磷酸化的EGFR表达水平明显高于亲本PC-9细胞。免疫荧光实验检测耐药细胞中钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平,提示PC-9/IR并没有发生上皮间质转化。利用全外显子测序,我们分别在PC-9和PC-9/IR细胞中鉴定出76,475和79,150个 SNPs,10,228 和 10,891 个插入缺失变化(insertions and deletions,indels)。与PC-9比较我们得出了 PC-9/IR细胞中有差异的183个单核苷酸变异(single nucleotide variations,SNV)和10个indels。此外,我们还发现PC-9/IR细胞中出现的3个CNV的变化:CAPN7的扩增,胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白2(Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2,IGF2BP2)和 KIAA0922(也称为 transmembrane protein 131-like,TMEM131L)的缺失。我们在DNA、mRNA、蛋白和细胞学不同水平对测序结果进行了验证,结果证实PC-9/IR细胞中存在T790M和RAS/Raf信号通路激活,使用针对T790M的三代EGFR-TKIAZD9291,以及RAS/Raf通路抑制剂U0126可以抑制耐药细胞的增殖。Real time PCR和WB实验结果表明PC-9/IR细胞中CAPN7在基因组DNA水平拷贝数出现扩增,在mRNA和蛋白水平的表达均高于亲本细胞。我们对EGFR-TKI耐药细胞A549和H1975细胞用大剂量icotinib进行了诱导,得到了耐药性更强的A549/IR和H1975/IR细胞。与诱导前相比,两者CAPN7在DNA水平拷贝数均出现扩增,提示CAPN7的扩增可能为icotinib特异性作用的结果。在mRNA和蛋白水平,H1975/IR细胞中CAPN7的表达高于诱导前细胞,在EGFR野生型的A549/IR细胞中CAPN7的表达与诱导前相比无显著性差异。结论:本研究成功建立了 icotinib耐药的NSCLC细胞PC-9/IR。利用全外显子测序技术分析PC-9/IR和PC-9细胞的基因组变异,通过生物信息学分析发现了icotinib耐药相关的183个SNVs,10个indels和3个CNVs,其中共有57个可能引起基因功能的变化。其中在PC-9/IR、A549/IR和H1975/IR细胞中,CAPN7在基因组DNA水平扩增;在PC-9/IR和H1975/IR细胞中,CAPN7在mRNA和蛋白水平的表达均高于诱导前细胞。以上结果提示我们CAPN7的扩增和表达增加与icotinib耐药相关,并且可能是icotinib特异性诱导的结果。
【图文】：

信号通路,信号转导分子,自磷酸化,抗凋亡

基的自磷酸化［８］。这些磷酸化的酪氨酸部分用作进一步下游信号转导分子的停靠逡逑位点，从而扩大信息，激活细胞内一系列的生化反应，如细胞增殖，抗凋亡，血逡逑管生成等（图１）。逡逑１逡逑

网格蛋白,泛素化,北京交通,硕士学位论文

北京交通大学硕士学位论文逦引言逡逑与ＥＳＣＲＴ－ＩＩ和－ＩＩＩ相互结合，ＥＳＣＲＴ复合物促进ＭＶＢ的膜内陷，，使得ＥＧＦＲ进逡逑入ＭＶＢ内形成小囊泡，最后在晚期内体／溶酶体中被降解［１（３］。综上，ＥＧＦＲ的内逡逑吞和降解是受网格蛋白所介导的磷酸化、泛素化和内吞体膜上特定的蛋白协同调逡逑节的转运过程。逡逑ＯＯ－ＥＧＦ逡逑ＰｌａｓｍａＣｌａｔｈｒｉｎ－＾逡逑
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】