UGT1A3作为肺腺癌预后指标和潜在治疗靶点的研究

发布时间：2020-03-23 22:54

【摘要】：研究背景及目的:肺癌发病率和死亡率在我国居各类癌症中均位居前列,严重威胁人类生命健康。肺腺癌是肺癌的主要病理类型之一。针对肺腺癌的药物层出不穷,但是临床疗效却不尽如人意。由于肺癌的早期症状不明显,故当患者确诊肺癌时,通常已经错过最佳治疗时机。肿瘤代谢是当前肿瘤研究的热点领域。肿瘤细胞的代谢特征与正常组织内的细胞差异较大,针对某些肿瘤代谢特征的靶向药物被认为是肿瘤药物研发的新方向。生物信息学是一门新兴的生物医学与信息学的交叉学科,目前已被广泛运用于基因筛查、分子诊断等领域。本研究基于临床患者数据,利用生物信息学技术,筛选出潜在的肺癌预后因子,并通过基础实验,探讨该指标作为肺腺癌治疗靶点的可能性和应用价值。研究方法:我们运用R语言对人类肿瘤基因组数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中的肺腺癌组织样本进行高通量筛查。筛选出差异表达明显的基因。同时我们利用TCGA数据库中样本附带的临床随访信息与该样本的基因表达信息合并后进行Kaplan-Meier分析,绘制生存曲线,再利用单因素COX回归模型,探讨差异表达的基因作为预后指标的应用价值。此外,我们还从山东省立医院组织库中调取肺腺癌的临床组织,运用实时定量PCR技术对生物信息学分析中筛选出的基因进行验证。筛选出潜在的预后基因后,我们运用抑制剂和转染小干扰RNA对该基因进行抑制或敲除。应用SRB染色法测定肺腺癌细胞系的生长及药物的半数抑制浓度;然后我们通过划痕试验和克隆形成试验,研究抑制剂或小干扰RNA对抑制肺腺癌细胞系的侵袭、迁移能力的作用;另外,我们应用流式细胞术研究肺腺癌细胞的细胞周期和凋亡;接着我们利用皮下种植瘤技术研究不同处理组对动物体内肿瘤增殖的作用。研究结果:与癌旁组织相比,UGT1A3在肺腺癌组织内高表达,差异倍数大于103(p0.0001),且UGT1A3的高表达与不良预后密切相关(HR=1.500,95%CI:1.053-2.138,p=0.0247)。基因富集分析表明,UGT1A3的作用集中在药物的体内代谢过程。体外实验中,敲除UGT1 A3能够显著抑制A549细胞增殖,促进其凋亡(p0.0001)。运用UGT1A3的抑制剂Hesperetin能够对A549细胞产生杀伤作用,IC50为 125.006±9.591μM,95%可信区间为121.425μM-128.588μM。同时,Hesperetin能够抑制A549细胞增殖,促进其凋亡,抑制侵袭和迁移。Hesperetin和卡铂联用能够显著增加A549细胞对卡铂的敏感性:联合用药组中卡铂的IC50为26.110±1.797μM,95%可信区间为25.439-26.781μM,与单用卡铂组相比,IC50减少为单用组的1/6。而在HBEC细胞系中,Hesperetin和卡铂联用能够显著拮抗卡铂的杀伤作用。相似地,联合用药组中,细胞增殖的抑制程度、凋亡数量和程度均显著高于单独用药组。动物实验结果表明,该联合用药方案在动物体内的效果与体外实验相似,联合用药组的肿瘤体积显著小于对照组和单独用药组(p0.0001)。结论:UGT1 A3是肺腺癌中潜在的预后因子,其抑制剂Hesperetin能够抑制肺腺癌细胞的增殖,促进凋亡,抑制侵袭和迁移,并能在增加肺腺癌细胞对铂类药物的敏感性的同时,减少铂类对正常支气管上皮细胞的杀伤作用。
【图文】：

细胞生长曲线,效率,转染,细胞增殖

图２．邋（Ａ）ＵＧＴ１Ａ３的敲除效率，我们利用ｓｉＲＮＡ转染来敲除ＵＧＴ１Ａ３，结果逡逑显示ｓｉＲＮＡ的敲除效率为３０％？５０％。（Ｂ）敲除ＵＧＴ１Ａ３对Ａ５４９细胞增殖的影逡逑响，我们利用磺酰罗丹明Ｂ邋（ＳＲＢ）染色法，对不同处理组的细胞于一定时间间逡逑隔后收样和固定，绘制细胞生长曲线，结果表明与对照组相比，敲除ＵＧＴ１Ａ３逡逑能够显著抑制Ａ５４９细胞增殖（ｐ＜０．０００１）。（Ｃ）Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ双染色法检测细逡逑胞凋亡，红色为ＰＩ染色的凋亡细胞，黄绿色为Ｃａｌｃｅｉｎ染色的活细胞，经统计，逡逑敲除ＵＧＴ１Ａ３对Ａ５４９细胞的凋亡无显著影响（ｐ＞０．０５）。（Ｄ）和（Ｅ）克隆形逡逑成实验，将一定数目的处理后的细胞接种到孔内，一定时间后固定染色，结果表逡逑明，ＵＧＴ１Ａ３组克隆形成数显著少于对照组（ｐ＜０．０００１），提示ＵＧＴ１Ａ３在Ａ５４９逡逑细胞的增殖中扮演重要角色。逡逑

曲线,杀伤作用,细胞的

图３．邋（Ａ）邋Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ对Ａ５４９细胞的杀伤作用。ＳＲＢ染色法绘制剂量－杀伤曲线，逡逑经计算，ＩＣ５０为邋１２５．００６±９．５９１ｎＭ，９５％可信区间为邋１２１．４２５ｎＭ－１２８．５８８ｐＭ。（Ｂ）逡逑Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ对Ａ５４９细胞增殖的影卩向，与对照组相比，Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能够显著抑制细逡逑胞增殖（ｐＯ．ＯＯＯｌ）。（Ｃ）Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ双染色法检测细胞凋亡，，结果显示，低逡逑浓度的Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能够轻微诱导Ａ５４９细胞凋亡。（Ｄ）和（Ｅ）划痕实验检测细逡逑胞侵袭迁移能力，血清浓度为１％，以0小时的划痕间距为参照，每隔一定时间逡逑对同一位置拍照，测量划痕间距。与对照组相比，Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ能够显著抑制Ａ５４９逡逑细胞的侵袭和迁移（Ｐ＜0．00５）。（Ｆ）和（Ｇ）克隆形成实验，细胞接种个数为每逡逑孑Ｌ邋２００个，生长时间为２周。结果表明，与对照组相比，低浓度Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ即可逡逑显著抑制Ａ５４９细胞系的增殖（ｐ＜０．００５）。逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【参考文献】