NK细胞通过上调miR-146b-5p抑制WBSCR22表达调控奥沙利铂耐药大肠癌细胞增殖及侵袭的机制研究

发布时间：2020-03-24 22:26

【摘要】：目的:自然杀伤细胞(NK cells)具有良好的抗肿瘤应用前景。本实验中我们将建立奥沙利铂耐药结直肠癌细胞模型,阐明NK细胞对奥沙利铂耐药细胞的细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力的影响,从而探索与NK共培养的结直肠细胞内miR-146b-5p的表达水平变化,阐明WBSCR22与miR-146b-5p之间的调节关系,最后探索miR-146b-5p在NK细胞抑制奥沙利铂耐药大肠癌细胞恶性进展中的作用。方法:将结直肠癌细胞RKO和DLD1用RPMI-1640培养基培养,加入奥沙利铂溶液建立耐药细胞株。通过CCK-8细胞增殖实验,克隆形成实验检测OR-DLD1和OR-RKO细胞的体外增殖活力和克隆形成能力。通过transwell小室细胞侵袭实验检测OR-DLD1和OR-RKO细胞的体外迁移及侵袭能力的变化。荷瘤试验检测NK细胞对OR-DLD1和OR-RKO细胞的异体成瘤能力的影响。体内外实时荧光定量PCR和Western blot实验检测OR-DLD1和OR-RKO细胞中,WBSCR22的mRNA和蛋白的表达水平,以及miR-146b-5p的mRNA表达水平。通过miRNA在线靶标预测网站miRanda,克隆构建了连接有WBSCR22基因3’UTR序列的双荧光报告基因质粒,并对预测的miR-146b-5p作用位点进行突变得到突变质粒。建立了稳定敲低miR-146b-5p表达的细胞株,并与NK细胞共培养或共注射,探索OR-DLD1-anti-control,OR-DLD1-anti-miR-146b-5p,OR-RKO-anticontrol和OR-RKO-anti-miR-146b-5p细胞株的体内外功能差异。结果:1在DLD1和RKO细胞基础上,建立了耐药细胞株并命名为OR-DLD1和OR-RKO,相对DLD1和RKO细胞,OR-DLD1和OR-RKO细胞在奥沙利铂作用下细胞增殖活力和克隆形成能力都显著性增强。2与NK细胞共培养的奥沙利铂耐药细胞株OR-DLD1和OR-RKO的体外增殖活力、克隆形成、迁移及侵袭能力均显著性下降,与NK细胞共注射的奥沙利铂耐药细胞株OR-DLD1和OR-RKO的体内成瘤能力显著性下降。3通过实时荧光定量PCR实验我们发现,相对未与NK共培养的对照细胞,与NK细胞共培养的OR-DLD1和OR-RKO细胞中,WBSCR22的mRNA表达水平均显著性下调。通过Western blot实验我们发现,相对未与NK共培养的对照细胞,与NK细胞共培养的OR-DLD1和OR-RKO细胞中,WBSCR22的蛋白质的表达水平均显著性下调。相对与未与NK细胞共培养的细胞,与NK细胞共培养的细胞中miR-146b-5p表达显著性上调。我们提取BALB/c裸鼠体内的OR-DLD1和OR-RKO移植瘤细胞中的miRNA,并通过实时荧光定量PCR实验发现,相对与未与NK细胞共注射的移植瘤细胞,与NK细胞共注射的移植瘤细胞中miR-146b-5p表达显著性上调。4双荧光报告基因实验表明miR-146b-5p能显著抑制连有WBSCR22的3’UTR野生型质粒的荧光素酶活性,而对突变型质粒的荧光素酶活性没有明显的影响。NK细胞共培养的细胞中连有WBSCR22的3’UTR野生型质粒的荧光素酶活性显著降低,而突变型质粒的荧光素酶活性没有明显的变化。5抑制miR-146b-5p的表达后,NK细胞对OR-DLD1和OR-RKO细胞在细胞活力、增殖、迁移及侵袭的抑制被显著性削弱。结论:1 OR-DLD1和OR-RKO细胞是对奥沙利铂耐药的耐药细胞株。2 NK细胞能抑制奥沙利铂耐药结直肠癌细胞株的体内外细胞活力、增殖、迁移及侵袭能力。上述实验表明,NK细胞能通过上调miR-146b-5p的表达来抑制WBSCR22的mRNA及蛋白的表达水平。miR-146b-5p能通过靶向WBSCR22的3’UTR抑制WBSCR22的表达。3 MiR-146b-5p是NK细胞抑制奥沙利铂耐药肠癌细胞细胞活力、增殖、迁移及侵袭的关键性效应分子。
【图文】：

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重庆医科大学博士研究生学位论文通过长时间持续用奥沙利铂作用于结直肠癌细胞 DLD1 和 RKO 得到耐 OR-DLD1 和 OR-RKO。细胞克隆形成实验显示，，在奥沙利铂作用下，耐药细胞株 OR-DLD1 相对于对照组的 DLD1 克隆形成数显著上升，表现性（图 1-1，A，p＜0.01）；奥沙利铂耐药细胞株 OR-RKO 相对于对照组的形成数同样显著上升（图 1-1，B，p＜0.01）。

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图 1-2 CCK-8 实验检测对奥沙利铂耐药的结直肠癌细胞株的建立**，p<0.01。e 1-2 Establishment of colorectal cancer cell lines resistant to oxaliplatin by cck: the difference of cell proliferation capacity between DLD1 and control cells unatin; B: difference of cell proliferation capacity between RKO cell lines and conunder oxaliplatin; (**, p<0.01).论前奥沙利铂（Oxaliplatin, OXA）是临床治疗结直肠癌的一线用药[31于大肠癌的治疗已有近二十年的时间，研究表明其能显著性延长患；大肠癌患者的中位生存期延长至 24 个月，约 25%的患者无复发生年。相对单独使用 5-氟尿嘧啶，奥沙利铂联合 5-氟尿嘧啶治疗后，率由 15%提高为 54%。卡铂或顺铂等其他铂类药物治疗无效的转移
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34

【参考文献】