【摘要】：研究背景:乳腺癌(Breast Cancer)目前已经成为女性癌症发病率的第一名。Cancer Statistics报道2016年美国新增乳腺癌患者1685,210例,死亡595,690例,总死亡率仅仅低于肺癌,位居第二位[1]。Cancer Statistics in China数据显示在我国乳腺癌的发病率逐年增加,在城市地区已经位列女性癌症死亡率的首位。虽然随着医疗水平的提高,乳腺癌的手术治疗、内分泌治疗、化学治疗等治疗手段的长足进步,死亡率有所下降,但是对于发生转移的乳腺癌仍没有行之有效的控制措施,最终导致治疗失败患者死亡[2]。乳腺癌根据ER(Estrogen receptor),PR(Progesterone receptor)以及HER2(Human epidermal growth factor receptor-2)为划分标准,主要分为4种类型:HER2过表达型(ER-/PR-/HER2+),luminal A,luminal B,三阴型(TNBC,ER-/PR-/HER2-)[3]。但乳腺癌属于异质性疾病,即使是同一个病理分型的病人之间由于分子水平上存在较大差异,治疗靶点也不尽相同[4]。随着大量的临床治疗数据的回馈,学者们越来越发现靶向治疗的重要性。ARPC2(Actin related protein 2/3 complex)是肌动蛋白相关蛋白复合体(Actinrelated protein,Arp)七个亚基其中之一[5],Arp是一种含量丰富的真核细胞蛋白。主要介导肌动蛋白单体和一些细胞内小分子、ATP相互作用多聚化,即肌动蛋白核化(nucleation),从而形成微丝组装成细胞骨架,维持细胞形态[6]。参与细胞分裂及细胞运动收缩,使吞噬微粒、病毒以及胞内寄生菌等多种胞内物质发生位移等多种生理功能[7-8]。ARPC2最先是在棘阿米巴中发现,主要在组织的细胞质和细胞膜中表达[9]。参与细胞内肌动蛋白聚合的控制,在进化上相对保守,迄今为止仅发现了两种可选剪接的变体,在微丝的核化中起关键作用[10-11]。相邻两条微丝通过分支处的ARPC2作用以70度角的方式进行连接,引起质膜的改变,使细胞运动前行。现阶段对于ARPC2在恶性肿瘤中所发挥的作用以及其潜在的作用机制的研究仍处于起步阶段。有研究发现ARPC2可以通过细胞内牵引力场调节细胞体力[12]。ARPC2在胃癌细胞中表达水平升高并且具有促进了胃癌细胞增殖和侵袭力的作用[13],但ARPC2在乳腺癌细胞中的具体生物学作用未见报道。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在乳腺癌转移发展过程中扮演重要的角色,N-cadherin,Vimtin,E-cadherin等标志物的改变提示EMT的发生。目前,已知多条信号通路参与调节EMT程序,如TGF-β,Hedgehog,Wnt以及Notch等,这些信号通路可以和一些转录因子形成复杂的信号网络,从而稳定和维持细胞的间质表型。肿瘤细胞中肌动蛋白可以通过结构变化利用变形场和已和已知基质的弹性物质引起肿瘤细胞骨架重塑,从而提高细胞内牵引力,提升肿瘤细胞迁移和侵袭能力。因此,我们推断ARPC2蛋白不仅具有调控乳腺癌细胞骨架重塑、细胞牵引力的作用,而且可能具有调控乳腺癌细胞增殖侵袭转移的作用。本课题发现ARPC2在乳腺癌癌旁正常组织中低表达,乳腺癌组织中高表达,并且和EMT标志蛋白有密切相关性。我们通过过表达或敲低乳腺癌细胞系ARPC2表达水平,利用细胞功能实验观察乳腺癌细胞的生物学功能变化,如增殖、侵袭、凋亡、周期等等,以及EMT各项指标的表达情况。发现ARPC2能够诱导乳腺癌细胞增殖获得间质细胞特征,增强细胞的迁移和侵袭能力;利用免疫共沉淀与质谱联用技术(IP-MS)筛选,查询差异蛋白GO富集分析和KEGG通路分析,发现ARPC2参与TGF-β/Smad信号通路。为了探讨ARPC2及TGF-β/Smad信号通路在乳腺癌EMT过程中的信号转导及相互作用机制,运用Western-blot技术检测TGF-β抑制剂(SB43)及TGF-β刺激后细胞EMT各指标的表达情况,发现ARPC2能够增强TGF-β信号通路,从而促进EMT的发生。同时在TGF-β诱导乳腺上皮细胞发生EMT的过程中,也能够上调ARPC2的表达,并且ARPC2的上调对于TGF-β诱导的EMT是必需的。本研究首次发现ARPC2能够促进乳腺癌细胞EMT转化程序导致乳腺癌侵袭迁移,通过参与乳腺癌细胞中TGF-β/Smad信号通路。这一发现为ARPC2作为预测乳腺癌预后的标志分子以及其作为乳腺癌靶向治疗的目标提供了重要的研究基础。研究目的:研究乳腺癌细胞株和乳腺癌患者中ARPC2的表达情况,并探讨其是否参与TGF-β介导的上皮间质转化进而影响乳腺癌的侵袭转移。研究内容:第一部分ARPC2在乳腺癌中的表达水平与作用收集安徽医科大学第一附属医院172例乳腺癌根治术后保存的乳腺癌组织及68例乳腺腺病组织,46例乳腺癌患者术前和50例正常体检的女性血清标本。所有纳入研究对象的乳腺癌患者术前均未接受过生物治疗、放化疗等治疗手段,与正常对照组的体检女性年龄无统计学差异,实验采用q RT-PCR、免疫印迹和免疫组化方法,检测血标本中ARPC2的m RNA水平和病理组织标本中ARPC2蛋白表达情况。同时收集整理乳腺癌患者的临床病理数据资料,内容包括肿瘤大小、临床分期、分级、预后以及EMT相关标志蛋白等,通过统计学相关性分析,探究ARPC2表达与乳腺癌临床病理特征之间的相关性。此外,收集乳腺表皮细胞系:MCF-10A和乳腺癌细胞株MCF7、BT474、T47D、MB-MDA-231,采用免疫印迹以及q RT-PCR的方法检测ARPC2基因的表达情况,同时分析ARPC2基因在不同乳腺癌细胞系中的差异性表达。通过挖掘公共在线数据库Oncomine microarray database和Bio Portal for Cancer Genomics(http://www.cbioportal.org/)中ARPC2在乳腺癌患者组织样本中的表达情况,分析ARPC2表达在乳腺癌组及正常对照组的差异,从而明确ARPC2在乳腺癌组织中的表达状态及其临床研究价值。第二部分ARPC2在乳腺癌进展中的作用以及初步机制研究我们前期的研究发现ARPC2与乳腺癌的预后有密切相关性,我们推测ARPC2可以作为一个促癌基因在体内加速乳腺癌的发展,为了进一步研究ARPC2对乳腺癌细胞的作用机制,探讨其生物学功能。采用si RNA技术在相对高表达ARPC2基因乳腺癌细胞MDA-MB-231中抑制ARPC2的表达,将过表达ARPC2质粒转染进相对表达量较少的MCF-7细胞株。采用MTT法检测细胞株的细胞增殖;流式细胞仪检测细胞株的细胞周期变化;Annexin V/PI法检测细胞株的凋亡情况;划痕实验、Transwell/Matrigel法观察细胞株迁移和侵袭的能力;平板克隆形成实验观察细胞增殖生长能力。阐述ARPC2表达对乳腺癌细胞增殖以及侵袭能力的影响。体内实验,雌性裸鼠皮下注射过表达ARPC2组和空质粒对照组的MCF7细胞,观察两组裸鼠移植瘤的生长速度、瘤体重量,肺部转移情况以及免疫组化检测瘤体Ki67的表达情况。利用免疫共沉淀串联质谱联技术(IP-MS)筛选ARPC2基因影响乳腺癌细胞的生物学行为的下游通路,通过免疫印迹和蛋白组学等方法验证用特异性抗体拉低ARPC2后乳腺癌细胞的具体调控机制,通过查询差异蛋白GO富集分析和KEGG通路分析,研究ARPC2和乳腺癌细胞EMT转化的相关性以及可能相关的下游通路。探讨ARPC2如何参与乳腺癌细胞EMT转化过程,以及其对乳腺癌细胞中TGF-β信号通路的调控作用。从而为ARPC2作为预测乳腺癌预后的标志分子,以及为作为乳腺癌靶向治疗的目标提供依据。研究结果:第一部分1.在46例乳腺癌患者和相应的50例健康体检女性血清标本中q RT-PCR检测结果显示:乳腺癌患者血清的ARPC2 m RNA水平相较于正常对照组较高(P0.05);2.免疫组化显示:ARPC2主要定位于乳腺上皮细胞和癌细胞的细胞质或者细胞膜上,172例乳腺癌组织中的ARPC2蛋白阳性细胞比例(48%)高于68例良性乳腺病组织(28%)(P0.05);3.免疫组化ARPC2的阳性表达情况与患者的肿瘤大小,病理学分期,淋巴结是否转移呈正相关,而与其它的其它病理特征如HER2表达量、ER与PR状态无关;4.公共在线数据库TCGA显示,与正常乳腺组织比较,乳腺癌组织ARPC2m RNA表达水平升高(P0.05);5.通过在线数据库Cbioporta生存分析发现ARPC2与乳腺癌患者的预后具有相关性;6.逆转录PCR和Western Blot结果显示:乳腺癌细胞株的ARPC2表达量相较于乳腺正常上皮细胞株MCF10A有所升高(P0.05)。第二部分1.在MDA-MB-231中转染si RNA和ARPC2-si RNA,在MCF7细胞中转染过表达质粒pc DNA3.1-ARPC2和空质粒,相应的ARPC2蛋白水平出现下降或者升高;2.转染ARPC2 si RNA下调ARPC2后导致细胞增殖、侵袭和迁移能力抑制,促进凋亡;3.注射过表达ARPC2的MCF-7细胞的裸鼠移植瘤生长速度、瘤体大小以及Ki67的表达量显著高于对照空质粒组(P0.05);4.蛋白组学分析显示:ARPC2的表达与粘附侵袭相关基因集有高度相关性;5.过表达ARPC2可以促进EMT的转化,激活TGF-β/Smad信号通路;6.ARPC2可以被TGF-β受体激酶抑制剂SB431542阻断TGF-β/Smad信号通路逆转对EMT的转化作用。结论:ARPC2在乳腺癌的发生发展中起促进作用,这一作用可能通过TGF-β/Smad信号通路介导的EMT转化作用产生。
【图文】：
ARPC2在乳腺癌租和健康对照组外周血中的表达水平
31图 2.1 免疫组化检免疫组化 ARPC2 的表达情况:(A)ARPC2 非肿瘤乳腺组织中低表达 (B)ARPC2 非肿瘤乳腺组织中高表达(C)ARPC2 乳腺癌组织低表达 (D)ARPC2 乳腺癌组织高表达
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
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本文编号：2601958
