沉默LncRNA-ATB靶向miR-141-3p抑制乳腺癌的转移和侵袭

发布时间：2020-03-30 17:58

【摘要】：目的:乳腺癌(breast cancer,BC)是来源于乳房组织的一种恶性肿瘤,是世界范围内女性最为常见的恶性肿瘤之一,成为女性死亡的“第二大杀手”~([1])。许多因素与乳腺癌的发生存在着潜在的联系,包括年龄、体重、激素的使用、吸烟等~([2])。在我国,乳腺癌女性数量逐年增多~([3])。因此,为了降低乳腺癌患者的死亡率,深入了解乳腺癌的发病机制,积极探索抑制乳腺癌发生与发展的治疗手段,从而提高乳腺癌患者的治疗有效率具有深刻的理论及现实意义。上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),是上皮细胞向间质细胞转化的过程,对胚胎发育、创口愈合、肿瘤转移等均有影响,是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要步骤~([4])。当肿瘤细胞发生侵袭转移时,EMT可诱导肿瘤细胞获得干细胞特性,如耐凋亡、免疫豁免等,从而促进肿瘤的侵袭转移,为治疗增添难度~([5,6])。因此,探寻新的抑制EMT的靶点及其潜在的分子机理有助于乳腺癌的治疗。随着越来越多的长链非编码RNA(Long non coding RNA,LncRNA)被研究发现,关于LncRNA与肿瘤的相关研究越来越得到专家学者的重视。LncRNA是非编码RNA的一个亚类,长度一般在200nt以上,具有相对保守的二级结构,但不具备蛋白编码能力~([7])。资料显示,LncRNA在生命活动过程中有更强的组织特异性和细胞特异性,能够通过调控mRNA和蛋白表达水平影响生物学行为。研究表明,在结直肠癌细胞中,上调LncRNA-PVT1能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖与侵袭~([8])。此外,在垂体腺瘤细胞中,通过上调E2F1,LncRNA-CCAT2能够被激活,并与PTTG1相互作用,进而在垂体腺瘤的发展过程中起到重要的调控作用~([9])。在乳腺癌中,LncRNA也具有重要的调控作用。研究表明,LncRNA-CCAT2能够通过抑制TGF-β信号通路,抑制乳腺癌细胞的增殖与转移;LncRNA-HOTAIR通过调控细胞自噬,在乳腺癌的发生与发展中发挥重要的作用~([10,11])。转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)激活的LncRNA(LncRNA-activated by TGF-β,LncR-ATB)作为LncRNA家族中的一员,在肿瘤的发生发展过程中具有重要的调控作用。LncRNA-ATB被证实在多种肿瘤细胞中存在异常表达。研究表明,在结直肠癌患者癌组织中,有LncRNA-ATB高表达的现象发生;在宫颈癌组织临床样本与宫颈癌细胞中,均存在LncRNA-ATB的高表达;在胃癌细胞中,LncRNA-ATB能够促进胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭~([12-14])。此外,研究发现,在乳腺癌细胞中,LncRNA-ATB同样具有重要的调控作用。根据相关文献报道,LncRNA-ATB通过调控上皮-间质转化(EMT)相关因子促进乳腺癌细胞的转移,但是这种调控是否与microRNA(miRNA)相关却鲜有报道。MiRNA是一类22 bp左右的内源性非编码RNA。众所周知,miRNA可以同时调节许多靶mRNA表达,从而对细胞增殖、分化、肿瘤转移及肿瘤血管形成等发挥调控作用~([15])。现如今,miRNA作为新的抗肿瘤治疗靶点的应用潜力得到越来越多学者们的认可。研究发现,在口腔癌患者体内,存在miR-150-5p、miR-222-3p与miR-423-5p表达量升高的现象;在多种癌症患者体内,miR-448能够靶向调控ROCK1,进而通过PI3K/AKT影响肿瘤的发生与发展过程~([16,17])。在乳腺癌中,miRNA同样具有重要的调控作用。研究发现,在乳腺癌患者体内,存在多种miRNA的异常表达,包括miR-548c-5p、miR-7-5p、miR-210-3p及miR-128-3p;miR-664通过靶向调控IRS1抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭~([18,19])。此外,研究表明,miR-577靶向抑制Rab25,进而抑制EMT相关因子的表达,在乳腺癌发生发展过程中发挥重要的调控作用~([20])。MiR-141-3p作为miRNA家族的一员,与肿瘤的发生与发展过程密切相关。根据相关文献报道,miR-141-3p能够通过抑制KLF9表达促进前列腺癌细胞的增殖;miR-141-3p在食管癌化疗耐药过程中同样具有重要的调控作用~([21,22])。此外,在乳腺癌细胞中,miR-141-3p通过靶向调控ANP32E,进而在乳腺癌细胞的迁移与侵袭过程中发挥重要的调控作用;在体内实验中,miR-141-3p对乳腺癌发展过程的调控作用同样得到了证实~([23,24])。然而关于miR-141-3p是否通过靶向调控作用,调控EMT相关因子的表达,进而调控EMT的发生与乳腺癌细胞的侵袭与转移却鲜有报道。近年研究发现,LncRNA可以作为ceRNA,竞争性结合miRNA,从而实现相互间的交流与调节。研究表明,LncRNA-SNHG1可以作为miR-145-5p的“分子海绵”,抑制miR-145-5p的表达,进而上调miR-145-5p靶基因MTGH,最终影响非小细胞肺癌的发展进程;在前列腺癌细胞中,LncRNA-PVT1抑制miR-186的表达,进而下调HIF-1α的表达,在胃癌细胞中起到至关重要的调控作用~([25,26])。在乳腺癌细胞中,LncRNA-SNHG15能够通过抑制miR-211-3p的表达,进而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭~([27])。此外,LncRNA-H19可以作为miR-200b/c与let-7b的“分子海绵”通过EMT与MET进程在乳腺癌细胞的发展过程中发挥重要的调控作用~([28])。然而LncRNA-ATB是否作为ceRNA,通过竞争性抑制miR-141-3p,进而影响乳腺癌细胞的侵袭与转移,需要进一步的完善。本研究通过检测LncRNA-ATB和miR-141-3p在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,分析LncRNA ATB和miR-141-3p与乳腺癌的相关性。进而通过细胞转染、Transwell、Real-time PCR与Western blot等技术手段,论证LncRNA-ATB和miR-141-3p对乳腺癌细胞侵袭与EMT的影响。最后miR-141-3p与靶基因,即EMT相关因子ZEB1、ZEB2的相互作用通过双荧光素酶报告基因技术与Western blot技术进行验证。阐述了LncRNA-ATB/miR-141-3p对乳腺癌细胞侵袭与转移的影响及相关分子机制,为乳腺癌的临床治疗提供了新靶点与新技术,具有重要的理论与现实意义。方法:利用Real-time PCR技术检测人正常乳腺细胞MCF10A与人乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549中LncRNA-ATB和miR-141-3p的相对表达量;采用LncRNA-ATB干扰载体转染并筛选人乳腺细胞株,在此基础上转染miR-141-3p inhibitor,利用Real-time PCR技术检测LncRNA-ATB低表达人乳腺癌细胞株中LncRNA-ATB和miR-141-3p的表达情况,利用Transwell技术检测LncRNA-ATB和miR-141-3p对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,EMT相关因子表达的变化通过Real-time PCR技术与Western blot技术被检测;双荧光素酶报告基因技术检测miR-141-3p对EMT相关因子ZEB1、ZEB2的靶向调控作用,miR-141-3p对EMT相关蛋白ZEB1、ZEB2蛋白表达的影响通过Western blot技术进行检测与分析。结果:与正常乳腺上皮细胞相比,在乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549中LncRNA-ATB的相对表达量显著升高,miR-141-3p的相对表达量显著降低;与阴性对照组细胞相比,LncRNA-ATB低表达人乳腺癌细胞株中LncRNA-ATB的相对表达量显著下降,miR-141-3p的相对表达量显著上升。与阴性对照组细胞相比,LncRNA-ATB低表达人乳腺癌细胞侵袭能力显著降低,EMT相关因子E-cadherin mRNA与蛋白水平的相对表达量均显著升高,EMT相关因子N-cadherin、vimentin、ZEB1、ZEB2 mRNA与蛋白水平的相对表达量均显著降低,与LncRNA-ATB低表达人乳腺癌细胞相比,共转染后,LncRNA-ATB低表达人乳腺癌细胞的侵袭能力显著升高,EMT相关因子E-cadherin mRNA与蛋白水平的相对表达量均显著降低,EMT相关因子N-cadherin、vimentin、ZEB1、ZEB2 mRNA与蛋白水平的相对表达量均显著上升;miR-141-3p对EMT相关因子ZEB1与ZEB2均具有靶向调控作用,且miR-141-3p抑制EMT相关因子ZEB1与ZEB2蛋白水平的相对表达。结论:乳腺癌细胞中存在LncRNA-ATB和miR-141-3p的异常表达;LncRNA-ATB竞争性抑制miR-141-3p的表达,促进乳腺癌细胞的侵袭与转移;LncRNA-ATB竞争性抑制miR-141-3p的表达,调控EMT相关因子E-cadherin、N-cadherin、vimentin、ZEB1和ZEB2 mRNA与蛋白水平的表达;miR-141-3p能够靶向抑制EMT相关因子ZEB1、ZEB2 mRNA与蛋白水平的表达。
【图文】：

乳腺癌细胞株,细胞株,人乳腺癌细胞

行实验的结果。使用 SPSS19.0 统计分析软件进行实验数据的统计与分析，采用单因素方差分析（ANOVA）对实验数据进行统计与分析，并通过 Bonforroni 法进行校正。P<0.05 差异有统计学意义。3 实验结果3.1 LncRNA-ATB 和 miRNA-141-3p 在正常乳腺细胞及乳腺癌细胞株中的表达通过 Real-time PCR 技术检测人正常乳腺细胞 MCF10A、人乳腺癌细胞MDA-MB-231 与 BT549 中 LncRNA-ATB 和 miRNA-141-3p 的相对表达量。结果如图 1.1 所示：与人正常乳腺细胞 MCF10A 相比，在人乳腺癌细胞 MDA-MB-23细胞与 BT549 细胞中，LncRNA-ATB 的相对表达量显著上升；miRNA-141-3p 的相对表达量显著下降。AB

乳腺癌细胞株,细胞,人乳腺癌细胞,博士学位论文

中国医科大学博士学位论文MDA-MB-231 及 BT549 中的相对表达（A：三种细胞中 LncRNA-ATB 的相对表达；B：三种细胞中 miR-141-3p 的相对表达）注：与 MCF10A 组相比，**P<0.013.2 LncRNA-ATB 与 miR-141-3p 的相关性分析构建 LncRNA-ATB 干扰载体及其阴性对照，转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231 细胞和 BT549 细胞。通过 Real-time PCR 技术检测 LncRNA-ATB 与miR-141-3p 的相对表达。实验结果如图 1.2 和 1.3 所示：与正常（CK）人乳腺癌细胞相比，LncRNA-ATB 低表达乳腺癌细胞（shRNA-ATB）LncRNA-ATB 的相对表达显著降低，，miR-141-3p 的相对表达显著升高。A B
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【相似文献】