Sp1-miR-3178-TRIOBP通路调控肿瘤转移机制研究

发布时间：2020-04-01 07:59

【摘要】：癌症是严重威胁人类健康的重大疾病。最新统计结果表明,截至2014年我国癌症发病率已接近0.2%,即每年每十万人中有200个新发癌症病例,且死亡率亦高达0.1%,即每年每十万人中有100人死于癌症。大约90%的癌症相关死亡可以归因于肿瘤转移,转移灶对病人生命健康的威胁远大于原发性肿瘤。肿瘤转移过程是多步骤复杂的级联反应,最初肿瘤细胞脱离原发灶迁移侵袭至周围组织器官,进而进入血管或者淋巴管中,借助于循环系统到达远端组织器官,在适宜条件下,循环肿瘤细胞渗出血管或淋巴管并在新的环境中增殖形成转移灶。人们对于肿瘤转移研究工作已经进行几十年,但目前仍有众多机制尚未明了。Specificity Protein 1(Sp1)是最早发现的转录因子之一,广泛参与调控细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生理过程,并且其异常表达与癌症发生发展密切相关。Sp1通过调控多种原癌基因以及抑癌基因的转录活性而影响肿瘤发生发展以及转移过程,如TP53、p21等都是Sp1靶基因。人类基因组中有超过12 000个Sp1结合位点,目前人们对于其转录调控的靶基因研究多集中于蛋白编码基因,而人类基因组中97%以上序列都为非编码基因,因此我们推测Sp1可能通过调控非编码基因影响癌症发展进程。Micro RNA是一类种间保守的小分子非编码RNA,长度只有19~22 nt,通过自身种子序列与靶基因m RNA以碱基互补配对方式结合,从而导致m RNA降解或抑制其翻译。近些年来人们发现micro RNA参与各种生理活动的调控,并且与肿瘤的发生发展以及转移过程密切相关。本研究首先利用蛋白酶体抑制剂处理细胞后,发现SP1表达水平降低,同时一系列mi RNA表达水平发生了变化,其中mi R-3178变化最为明显。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌细胞系中SP1表达水平与mi R-3178负相关,过表达外源SP1导致mi R-3178表达水平降低。通过生物信息学方法预测,发现mi R-3178启动子区域包含三个潜在的Sp1结合位点,分别位于转录起始位点上游-799至-788bp、-97至-88 bp、-82至-73 bp处。通过荧光素酶报告基因检测系统以及染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验,证明Sp1通过结合至mi R-3178启动子上游-82至-73bp处结合位点抑制其转录活性。利用在线数据库Oncomine与GEO,分析比较临床肿瘤患者组织中SP1表达水平,发现其在转移灶中表达水平显著增高。对比不同转移能力肿瘤细胞系发现高转移细胞中mi R-3178表达水平明显低于相应低转移细胞系。利用划痕实验以及Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭,发现mi R-3178在体外显著抑制肿瘤细胞的迁移与侵袭能力。利用裸鼠转移模型以及活体成像系统观察到前列腺癌细胞在肺脏、肝脏以及淋巴结中可形成明显的转移灶。通过HE染色,并利用标记肿瘤细胞的红色荧光蛋白指示定位,同时结合DAPI染色方法证实这些远端组织中转移灶的存在;而mi R-3178过表达则明显抑制转移灶形成,故体内实验进一步证实mi R-3178对肿瘤转移的抑制作用。TRIO and F-actin binding protein(TRIOBP)通过促进伪足的形成而影响胰腺癌的侵袭与浸润。TRIOBP蛋白有三种异构体,分别为TRIOBP-5/4/1,在本研究所使用的细胞系中TRIOBP-1是主要表达形式,TRIOBP-5表达水平较低,而TRIOBP-4不表达。利用在线生物信息学软件预测,在TRIOBP m RNA 3'UTR区域存在mi R-3178种子序列的互补序列。通过双荧光素酶报告基因分析证实mi R-3178能够结合至TRIOBP的3'UTR区域并抑制荧光素酶活性。高转移细胞系其TRIOBP表达水平明显高于相应的低转移细胞系,利用mi R-3178类似物或抑制剂改变细胞内mi R-3178水平后,TRIOBP的m RNA以及蛋白水平也相应下调或上调。另外,TRIOBP-1能够回复mi R-3178对于肿瘤转移能力的抑制作用,表明mi R-3178通过靶向TRIOBP抑制肿瘤转移。最后对TRIOBP启动子区域进行转录因子预测,并通过Ch IP实验证明该启动子区域不含Sp1结合位点,Sp1不会通过结合TRIOBP启动子区域调控其转录活性。综上所述,本研究揭示了Sp1-mi R-3178-TRIOBP通路对于肿瘤转移的调控。通过体内外实验证实mi R-3178通过靶向TRIOBP影响肿瘤细胞的迁移与侵袭能力,进而影响癌症的转移进程。而mi R-3178启动子区域存在Sp1结合位点,后者抑制mi R-3178的转录活性。鉴于Sp1在转移能力较强的肿瘤组织中普遍高表达,本研究提示利用mi R-3178降低Sp1高表达癌细胞转移能力的潜在应用。
【图文】：

年龄段,伪足,肿瘤转移,细胞运动

哈尔滨工业大学理学博士学位论文面伪足形成以及细胞运动等生理过程，另外在肿瘤细胞渗出血管淋巴管也与细胞骨架重构以及侵袭性伪足形成相关，因此 TRIOBP 通过调控细以及伪足形成影响肿瘤转移多个不同环节。综和上述报道以及本课题初结果，，Sp1-miR-3178-TRIOBP 通路中三个节点在肿瘤转移过程中起到控作用。鉴于 Sp1 异常表达在多种肿瘤中普遍存在，该通路对于临床中瘤转移具有较大的潜在应用价值。20040

过程图,肿瘤转移,过程,肿瘤细胞

第 1 章绪论MMP-9 等[4, 5]，已经被报道在各种肿瘤细胞中表达明显升高。在入侵血管或者淋巴管后，肿瘤细胞即可借助于循环系统到达远端的组织器官，进而渗出血管淋巴管（Extravasation）。肿瘤细胞渗出血管的过程需借助一系列细胞因子的帮助。有报道表明，肿瘤细胞能够分泌一系列分子，如 Angptl4、COX-2、MMP-1等，导致转移灶部位器官毛细血管通透性增加，以利于自身通过[6, 7]。到达远端组织器官后，肿瘤细胞需要适应新的环境并继续扩增形成转移灶。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-37

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