C反应蛋白对舌鳞状细胞癌的作用及机制的初步研究

发布时间：2020-04-06 03:44

【摘要】：目的:舌鳞状细胞癌(Tougue squamous cell carcinoma,TSCC)是头颈颌面部一种常见的恶性肿瘤,具有高侵袭性的生长方式和早期淋巴结转移的特性。尽管舌癌的治疗包括手术、放疗和化疗已取得了重大进展,但因舌鳞癌手术采取舌体扩大切除及选择性颈淋巴结清扫,术后常造成患者的咀嚼和言语等功能障碍和面部容貌的畸形,极大地影响患者术后的生存质量和心理健康。新的治疗方法如基因治疗、靶向治疗和生物治疗等因有可以选择性地作用于肿瘤细胞而极少损伤人体正常细胞的优势越来越受到人们的关注。舌鳞状细胞癌的生长、侵袭和转移不仅取决于肿瘤细胞本身的特性,还依赖于肿瘤细胞所处的微环境中的一些因素。因此,影响肿瘤发生发展的微环境因素成为现阶段肿瘤治疗的研究热点。炎症与肿瘤的关系在肿瘤学的研究中越来越受到重视。肿瘤微环境里存在的炎症调节因子能够促进肿瘤的发生发展,如其可以促进恶性肿瘤细胞的生长,加快其分裂增殖,促血管增生和肿瘤细胞的侵袭转移,并且降低机体的固有性免疫和获得性免疫能力,改变机体对激素和化疗药物的敏感性。微环境中的炎症介质如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素 6(interleukin-6,IL-6)、干扰素等对肿瘤细胞的生长增殖、侵袭、迁移和凋亡具有重要的调控作用。炎症调节因子在肿瘤发生发展中的重要的调控作用使得炎症介质成为肿瘤治疗的重要靶点。如同其它炎症介质,C反应蛋白(C reactive protein,CRP)是一种机体发生各种急慢性炎症或受到损伤后的敏感的急性时相反应蛋白。CRP在肝脏中合成后通过血液循环分泌到各个组织器官,通过与配体结合来识别多种内源性(如坏死衰老癌变的细胞)和外源性物质(如细菌)而显现出大量的生物活性。CRP与感染性炎症及心血管系统疾病密切相关。现阶段国内外很多学者研究发现,癌症患者血清中CRP的浓度明显高于正常人,其浓度升高的程度与肿瘤大小、临床分期及病理分型有一定的相关性,而且CRP血清水平还与治疗疗效和术后复发率有关。然而现阶段对CRP的研究仅限于血清中CRP的浓度与肿瘤关系的统计学研究,肿瘤微环境中的CRP对肿瘤细胞的直接作用研究很少。因此,本课题以CRP为靶因子,利用免疫组织化学研究CRP在舌鳞癌组织和细胞中的表达分布情况,并将外源性的重组人CRP与舌鳞癌细胞共培养,采用CCK-8(Cell counting kit-8)、Transwell 小室、划痕实验、Annexin V-FITC/PI 双染、Western Blot及免疫共沉淀等技术研究其对舌鳞癌细胞生长增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学行为的影响及其介导的信号转导通路和分子调节机制,以期为舌鳞癌的临床治疗提供新的治疗思路和实验数据。材料与方法:本课题分为三部分:第一部分:研究CRP在舌鳞状细胞癌组织和细胞中的表达实验一:CRP在舌鳞状细胞癌组织中的表达收集舌鳞癌组织42例,制作石蜡切片,梯度酒精入水,0.1%胰酶消化液抗原修复,滴加3%双氧水,正常山羊血清封闭,CRP抗体4℃湿盒孵育过夜。滴加生物素化二抗工作液和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶。DAB显色,苏木素复染,脱水,封片。用Image Pro Plus 6.0软件测定累积光密度(IOD SUM)及目标区域面积(area),计算平均光密度值(mean density),mean density=(IOD SUM)/area。收集并整理每个患者的临床资料,采用单因素方差分析或t检验进行统计学分析。实验二:CRP在舌鳞状细胞癌细胞中的表达1.舌鳞癌细胞分泌CRP的研究CAL27、SCC4及SCC25细胞常规培养24 h,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测培养基中CRP的含量。2.Western blot检测舌鳞癌细胞中CRP的表达CAL27、SCC4及SCC25细胞常规培养24h,提取细胞总蛋白,蛋白含量测定,SDS-PAGE电泳,转膜,免疫反应,显影。第二部分:研究CRP对舌鳞癌细胞生长增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学行为的作用1.CCK-8检测细胞增殖在96孔板中加入细胞(CAL27和SCC4细胞)悬液(100μl/孔,细胞密度为3.5×104个/ml),检测CRP效应浓度实验采用含有不同浓度CRP(0、5、10、20、30 μg/ml)的DMEM培养细胞24 h。检测CRP作用时间实验采用含有不同浓度(5、10、20μg/ml)CRP 的 DMEM,分别培养细胞 48、36、24、12、6、0h。每孔中加入10μlCCK-8溶液,用酶标仪测定每孔的吸光度值。2.Transwell小室检测细胞侵袭CAL27细胞在无血清的培养基中饥饿24 h,同化处理。在培养室的上腔分别加入200 μμl细胞悬液(细胞密度为4×105个/ml),下腔中分别加入无血清、含10μμg/ml CRP及10%FBS的DMEM各500μ1,培养24 h。4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,倒置显微镜下计数。3.划痕实验检测细胞迁移在6孔板中加入CAL27细胞悬液(2 ml/孔,细胞密度为4×105个/ml),待细胞生长融合至90%时,用200 μl的枪头在每孔底部划痕。每孔中加入不同条件的培养基(无血清DMEM、无血清DMEM+CRP(10 μg/ml)、含有10%FBS DMEM),分别在0、6、12、18h时取样,拍照,测量。4.Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡在6孔板中加入CAL27和SCC4细胞悬液,采用不同条件的培养基(无血清DMEM、无血清DMEM+CRP(10μg/ml);正常培养基、含CRP的正常培养基、含顺铂(Cisplatin,DDP;2 μg/ml)的正常培养基、含DDP和CRP的正常培养基)培养24 h。按照凋亡检测试剂盒说明书加入凋亡试剂后采用流式细胞仪检测细胞凋亡。5.Western blot 检测细胞核增殖抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达在6孔板中加入CAL27细胞悬液,采用含有CRP(10 μg/ml)的培养基,分别培养48、36、24、12、6、Oh。采用Western blot检测PCNA的表达变化。第三部分:研究CRP作用舌鳞癌细胞过程中可能结合的受体及激发的信号调节通路实验一:CRP作用舌鳞癌细胞CAL27过程中可能结合的受体1.免疫荧光染色检测CAL27细胞表面受体的表达细胞爬片,4%多聚甲醛固定,0.2%Triton X 100通透,血清封闭液封闭,滴加一抗(Fcγ Ⅰ、FcγⅡ、FcγⅢ)4℃湿盒孵育过夜。暗室中滴加荧光二抗和DAPI,封片,荧光显微镜下观察。2.免疫共沉淀检测CRP与CAL27细胞表面受体的结合细胞生长融合至100%时,实验组加入CRP(25 μg/ml)孵育30 min,对照组中加入PBS。裂解细胞提取蛋白,加入兔来源的CRP抗体后,再加入Agarose A/G进行结合反应,蛋白变性。采用Westernblot检测所形成的免疫复合物。实验二:CRP作用舌癌细胞CAL27过程中所激发的AKT/mTOR/S6信号通路的研究1.Western Blot检测AKT/mTOR/S6信号通路蛋白的表达变化在6孔板中加入细胞悬液,待细胞生长融合至70%左右后,采用含有CRP(10μg/ml)的培养基分别培养细胞 0、15、30、60、120 和 0、30、60、120、180、240 min。采用 Western Blot 检测 pAKT、pmTOR、pS6、pNF-KB、pERK 蛋白的表达变化。2.CCK-8检测在培养基中加入mTOR的抑制剂-雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)后细胞的增殖状况在96孔板中加入细胞悬液,采用含有不同成分的培养基(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA),培养 48、36、24、12、6、0h。采用CCK-8检测细胞的增殖状况。雷帕霉素(RAPA)的终浓度为2 μm/L。3.Western Blot检测在培养基中加入雷帕霉素后PCNA的表达变化常规细胞铺板,加入含有不同成分(DMEM+DMSO,DMEM+CRP,DMEM+CRP+RAPA,DMEM+RAPA)的培养基培养24 h。Western Blot 检测 PCNA的表达变化。实验三:CRP作用舌癌细胞CAL27过程中所激发的Caspase 3/9凋亡信号通路的研究常规细胞铺板,分别加入含2 μg/ml DDP和PBS、含2 μg/ml DDP、含2 μg/ml DDP和10 μg ml CRP 的 DMEM,培养 CAL27 细胞 24 h。Western Blot 检测Cleaved PARP、Cleaved Caspase-3 和 Cleaved Caspase-9 的表达变化。结果:1.CRP在舌鳞癌组织中呈阳性表达,而且舌鳞癌细胞可能产生及分泌CRP1.1.CRP在癌旁正常组织中无表达,在舌鳞癌组织中呈阳性表达免疫组织化学结果显示,CRP在癌旁正常组织中无表达,在舌鳞癌组织中呈现阳性表达,CRP主要表达于癌细胞的细胞质中。CRP的表达强弱与肿瘤大小、病理分型及有无淋巴结转移有关,而与年龄、性别无关。CRP在中低分化的舌癌组织中表达强于在高分化的舌癌组织中,而且,CRP在有淋巴结转移的舌癌组织中表达更强。1.2.舌鳞癌细胞可能产生及分泌CRPELISA结果显示不同舌鳞癌细胞系培养基中均含有不同含量的微量CRP,而在无细胞的培养基中没有检测到CRP。Western Blot结果显示在不同舌鳞癌细胞中都有CRP的表达。2.CRP促进舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,降低饥饿和DDP诱导的舌癌细胞的凋亡CCK-8结果显示CRP能明显促进CAL27和SCC4细胞的增殖,并呈剂量及时间依赖性。CRP浓度在5μg/ml和10 μg/ml时对细胞的促增殖作用逐渐增加,在10 μg/ml时其对细胞的促增殖作用最明显,增加CRP浓度至20 μg/ml和30 μg/ml时,其增殖效果无明显增加。采用浓度为5、10和20 μg/ml CRP作用舌癌细胞24 h时增殖作用最明显,随着作用时间延长至36 h和48 h,CRP的促增殖效应减低。Western Blot结果显示PCNA在10μg/ml CRP作用24 h时表达量最高。Transwell小室和划痕实验显示CRP能明显促进舌癌细胞CAL27的侵袭和迁移。10 μg/ml CRP作用舌癌细胞24 h后,穿过多聚碳酸膜的细胞数明显多于阴性空白对照组。10μg/mlCRP作用舌癌细胞6h、12h和18h后,细胞迁移的距离分别是空白对照组的1.3、2和1.5倍。Annexin V-FITC/PI双染显示10 μg/ml CRP作用舌癌细胞CAL27和SCC4细胞24 h后,饥饿和DDP诱导的细胞凋亡率降低了接近50%。3.CRP可以结合CAL27细胞表面的Fcγ Ⅰ受体,上调AKT/mTOR/S6增殖信号通路,下调Caspase-3/9凋亡信号通路3.1.CRP可以结合CAL27细胞表面的Fcγ Ⅰ受体免疫荧光显示CAL27细胞表面表达FcγⅠ、FcγⅡ和FcγⅢ受体。免疫共沉淀显示CRP可以结合Fcγ Ⅰ受体形成复合物蛋白沉淀。3.2.CRP可以上调AKT/mTOR/S6增殖信号通路Western blot 结果显示 10 μg/ml CRP 作用 CAL27 细胞到 15、30、60 min 时,pAKT和pmTOR表达逐渐升高,pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值逐渐升高,当作用时间延长至120 min时,pAKT和pmTOR表达下调,pAKT/AKT和pmTOR/mTOR的值降低。CRP作用到30 min时,pS6表达上调,pS6/S6的值升高近0.5倍,当作用时间延长至60 min和120 min时,pS6表达减少,pS6/S6的值降低。pNF-KB在CRP作用过程中表达量没有明显变化。在CRP的作用时间从0 min延长至240 min时,pERK/ERK逐渐降低。在培养基中加入雷帕霉素后,CCK-8结果显示细胞的增殖明显低于只加入CRP组。Western Blot结果显示加入雷帕霉素组,PCNA蛋白的表达量明显低于CRP组。3.3.CRP可以下调Caspase-3/9凋亡信号通路Western Blot结果显示加入CRP培养24 h后,Cleaved Caspase-3蛋白的表达减少,Cleaved PARP和Cleaved Caspase-9蛋白的表达也减少。结论:1.CRP可能在舌鳞癌的发生发展中起了重要的促进作用。2.CRP能促进舌鳞癌细胞的增殖、侵袭和迁移,降低饥饿和DDP诱导的舌癌细胞的凋亡率。3.CRP可能通过结合舌癌细胞表面的Fcγ Ⅰ受体来影响舌癌细胞的生物学行为。4.CRP可能通过AKT/mTOR/S6信号通路促进舌癌细胞CAL27的增殖,从而影响肿瘤的发生发展。5.CRP可能通过减少Caspase-3/9蛋白的活化降低DDP诱导的CAL27细胞的凋亡率。
【图文】：

舌癌,舌体,强弱,高分化

逦山东大学博士学位论文逦逡逑结果逡逑１．ＣＲＰ在癌旁正常舌体组织及舌癌组织中的表达逡逑免疫组化结果显示ＣＲＰ在正常舌体组织中无表达，而在舌癌组织中呈阳性逡逑表达，但表达强弱不一致。ＣＲＰ阳性反应物呈棕黄色或棕褐色颗粒样沉积，主逡逑要沉积于细胞质中（图１－１）。逡逑

癌细胞,培养基,中都

ＥＬＩＳＡ结果显示不同舌癌细胞系培养基中含有不同含量的微量ＣＲＰ而在无逡逑细胞的培养基中没有检测到ＣＲＰ。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ结果显示在不同舌鳞癌细胞中都逡逑有ＣＲＰ蛋白的表达（图１－２）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑０．１０－１逡逑＿邋０．０８－逦＿ｍ＿逦ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑ｇ邋０．０６－逡逑＾逦ｍｍｍ邋ＣＲＰ逡逑0．０２＿逦１邋＂Ｔ邋｜逦Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑0．00Ｊ——，逦逦，，一＂￣■邋■邋ｒ」—逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＣＡＬ２７邋ＳＣＣ４邋ＳＣＣ２５逡逑图１－２．舌淲癌细胞可以分泌ＣＲＰ。（Ａ）邋ＥＬＩＳＡ结果显示不同舌癌细胞系培养基中含有不逡逑同含量的微量ＣＲＰ而在无细胞的培养基中没有检测到ＣＲＰ。（Ｂ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ显示在不同逡逑舌癌细胞中都有ＣＲＰ蛋白的表达。逡逑３５逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.86

【参考文献】