IRS-1靶向MAPK和PI3K信号转导通路介导胰腺癌细胞生物学功能改变的机制研究

发布时间：2020-04-16 20:54

【摘要】：前言:世界范围内胰腺癌均为一种高致死性预后极差的恶性肿瘤,其总体五年生存率不足5%,目前手术切除仍为胰腺癌的主要治疗手段,但是只有10-20%胰腺癌患者具有手术适应症,50%患者已经远处转移,35%患者出现不可切除的局部侵袭。因此,尽管科学家致力于研究胰腺癌的发生发展及侵袭转移过程,但胰腺癌的治疗仍不尽人意,其侵袭转移的分子生物学机制尚未完全明了。胰腺癌细胞蛋白质翻译后修饰过程可能在调节细胞功能方面具有重要作用,然而该作用机制并未完全阐明。因此,明确肿瘤细胞的磷酸化作用,探究肿瘤细胞整个蛋白磷酸化谱意义明显。目前,据了解,在胰腺癌的研究领域并没有针对同源性细胞(高侵袭转移习性的PC-1.0和低侵袭转移习性的PC-1)蛋白磷酸化谱的研究。本研究利用磷酸化蛋白芯片技术筛选PC-1和PC-1.0细胞中表达差异的蛋白及磷酸化位点,并对其中452个蛋白的582个磷酸化位点进行比对。此外,本研究中明确的磷酸化蛋白相关信号转导通路中各因子表现出明显变化。PI3K/PTEN/Akt/mTORC1和Raf/MEK/ERK是公认的胰腺癌中的活化通路。这些通路的下调将导致持续的细胞增殖,组织细胞的衰老和凋亡,并使细胞具有耐药性。MAPK信号转导通路是细胞外信号传递入核的重要通路,并具有高度保守性。该通路能将基因信息传递入核,并调节细胞增殖、分化、凋亡、基因表达和细胞对外界环境反应。以上述通路中关键蛋白为靶点,将成为胰腺癌和其他肿瘤的新型治疗方法。我们用液相色谱-质谱联用方法筛选PC-1和PC-1.0中差异表达的上清蛋白。LAR,又叫蛋白酪氨酸磷酸酶受体型F(PTPRF),是该试验筛选出的一种蛋白,其在PC-1中表达量为PC-1.0的2倍。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)是调节多种细胞进程的重要蛋白,包括调节细胞生长、分化、有丝分裂周期和癌症转化过程。前期我们利用磷酸化蛋白芯片检测高侵袭转移习性的PC-1.0和低侵袭转移习性的PC-1蛋白磷酸化水平的差异。令人感兴趣的是,IRS-1的Ser636位点在PC-1细胞中的磷酸化水平与PC-1.0相比的比值为0.43。这一结果提示我们IRS-1可能在胰腺癌的侵袭转移过程中起关键性作用。本研究利用特异性siRNA瞬势转染高侵袭性细胞系PC-1.0及与其生物学功能相似的人类胰腺癌细胞Aspc-1,观察经siRNA转染前后各细胞系在增殖,侵袭和转移方面的变化。以明确IRS-1在胰腺癌细胞中的分子生物学作用。并进一步探究IRS-1及上下游关键分子的相互作用关系,以明确其在胰腺癌侵袭转移过程中的具体作用。从而为胰腺癌早期诊断和临床治疗寻找新靶点。材料与方法实验材料:仓鼠胰腺癌细胞株PC-1和PC-1.0以及人类胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2获赠于日本熊本大学。主要研究方法:1、磷酸化蛋白芯片检测磷酸化蛋白谱:PC-1和PC-1.0细胞裂解产物用磷酸化探针抗体芯片(Full Moon Biosystems,Sunnyvale,CA,USA)进行检测。用抗体列阵工具分析提取出的包含多种蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液,该操作过程按厂家提供的操作流程进行。芯片用GenePix 4000扫描仪进行检测所得图像用GenePix Pro6.0(Molecular Devices,Sunnyvale,CA,USA)进行图像处理。芯片结果经由western blot验证。2、蛋白表达情况检测:用western blot检测IRS-1、LAR、AKT、MEK1和MEK2的总蛋白及磷酸化蛋白表达情况。3、Real-time PCR:检测IRS-1、LAR经siRNA瞬势转染前后的基因表达情况。4、形态学观察:显微镜下观察IRS-1瞬势转染前后的细胞形态学变化。5、体外侵袭实验:用Transwell实验检测IRS-1瞬势转染前后的侵袭能力变化。6、体外迁移试验:用Wound healing实验检测IRS-1瞬势转染前后的迁移能力变化。7、细胞增殖实验:用CCK-8细胞增殖实验检测IRS-1瞬势转染前后的细胞增殖变化。8、统计学处理:每次实验独立重复3次,采用spss13.0统计软件包对数据进行统计分析,结果以平均值±标准误(SEM)表示,两组间数据分析以Student’s t检验或方差分析表示,以P0.05认为具有统计学意义。结果:1、我们利用磷酸化蛋白芯片分析了1318个靶点,以表达差异2倍为入选标准。57种蛋白入选,其中32种蛋白在PC-1.0中的表达量明显高于PC-1;而25种蛋白在PC-1.0中表达明显下调。2、为了验证磷酸化蛋白芯片的结果,我们从芯片结果中随机抽取了6种蛋白利用Western Blot进行蛋白表达水平验证。实验结果显示6种蛋白表达量在PC-1.0细胞中均升高,与芯片结果一致并证实了芯片结果的可靠性。3、我们利用侵袭和迁移实验进一步明确蛋白磷酸化水平的不同对高侵袭细胞系PC-1.0细胞侵袭转移的影响。Transwell及Wound healing实验结果证实FOS、IRS-1和RAF1经siRNA或小分子化合物处理后PC-1.0细胞的侵袭及迁移能力明显降低。4、我们用与PC-1和PC-1.0生物学功能性相似的人类胰腺癌细胞Aspc-1和Capan-2进行验证,以明确仓鼠胰腺癌细胞实验结果是否与人类胰腺癌细胞一致,实验结果表明仓鼠胰腺癌细胞和人类胰腺癌并无显著差异,说明仓鼠胰腺癌细胞实验结果在人类胰腺癌细胞中同样适用。5、形态学观察发现抑制IRS-1后,原本粟粒状散在生长并具有伪足的的细胞变为聚合或集落样生长并且伪足消失。6、阻断IRS-1能有效抑制胰腺癌细胞侵袭过程。7、阻断IRS-1能有效抑制胰腺癌细胞迁移过程。8、阻断IRS-1能有效抑制胰腺癌细胞增殖过程。9、LAR对IRS-1蛋白水平及磷酸化水平具有负向调控作用。10、IRS-1对MEK1、MEK2和AKT蛋白水平及磷酸化水平具有正向调控作用。11、IRS-1调节胰腺癌细胞侵袭转移过程是通过介导MEK1、MEK2实现的;调节胰腺癌细胞增殖过程是通过介导MEK1和AKT实现的。结论:1、利用芯片筛选并验证胰腺癌侵袭转移相关蛋白。2、明确IRS-1在仓鼠胰腺癌细胞和人类胰腺癌细胞中表达情况类似。3、抑制IRS-1能下调胰腺癌细胞增殖、侵袭及转移过程。4、明确LAR负向调控IRS-1,IRS-1正向调控MEK1、MEK2和AKT。5、IRS-1调控胰腺癌细胞增殖、侵袭及转移过程是通过介导MEK1、MEK2和AKT实现的。
【图文】：

表 2：高侵袭转移型细胞（PC-1.0）相对于低侵袭转移型细胞（PC-1）中表达量下调最多的 1种基因。3.2 差异表达蛋白的验证及功能解析为了验证磷酸化蛋白芯片的结果，我们从中随机抽取了 6 种蛋白利用 WesterBlot 进行蛋白表达水平验证。实验结果显示 6 种蛋白表达量在 PC-1.0 细胞中均升高（图 1），与芯片结果一致并证实了芯片结果的可靠性。我们利用侵袭和迁移实验进一步明确不同的蛋白磷酸化水平对高侵袭细胞系 PC-1.0 细胞侵袭转移的影响。首先利用Western Blot及real-time PCR验证各种蛋白经siRNA或小分子化合物处理后的抑制效率。Transwell 及 Wound healing 实验结果（图 2）证实 FOS、IRS-1 和 RAF经 siRNA 或小分子化合物处理后 PC-1.0 细胞的侵袭及迁移能力明显降低。

图 2 下调 PC-1.0 细胞各种蛋白磷酸化水平影响侵袭转移过程图 2，，磷酸化水平差异表达的蛋白在 PC-1.0 细胞的侵袭转移过程中起重要作用。（A）PC-1.0 细胞中三种蛋白在经 siRNA 或小分子化合物抑制后对细胞迁移能力的影响。经处理的细胞孵育 24 小时。结果经计算后用图表表示。p＜0.01（n=3）；（B）Transwell 实验组与对照组分别计数。实验独立重复 3 次。p＜0.01（n=3）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

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本文编号：2630023