抗小鼠肝癌细胞Hepa 1-6单克隆抗体筛选和鉴定及其肿瘤治疗效果评估

发布时间：2020-04-20 16:29

【摘要】：肝癌是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一。目前肝癌的发生率和死亡率仍然处于居高不下的状态,其主要还是由于早期诊断率低并且缺乏非常有效的治疗手段。根治性治疗(肝切除、局部消融、肝移植)是肝癌病人获得长期生存的最主要途径,但仍然存在治疗不彻底、易复发的风险。然而,大部分肝癌患者往往到中晚期才被发现,疾病已经发生了转移,错过了最佳的治疗时机。目前针对晚期肝癌的治疗手段非常有限,索拉非尼是第一个FDA批准用于治疗肝癌的小分子靶向药物,但治疗效果仍不理想,患者中位生存期仅可延长3个月。近年来免疫检验点药物的临床应用为肿瘤的治疗带来了新的突破,但是PD-1抑制剂免疫疗法治疗晚期肝癌的客观应答率仅为18%,大部分患者并不能获益于这类新疗法。尽管还有少部分其它抗肝癌药物处于临床研究阶段,但是要达到治愈肝癌的目的仍然有很长的路要走。因此,开发一种针对肝癌新型、有效的靶点或药物,具有重要而迫切的现实意义。本研究旨在筛选获得具有治疗潜能的针对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6特异性的单克隆抗体,并期望鉴定出这些小鼠肝癌治疗性单抗所识别的靶标分子。为此,开展了以下工作:本研究首先利用ELISPOT酶联免疫斑点检测法建立体外筛选小鼠Hepa 1-6肝癌特异性单克隆抗体的细胞筛选平台。本研究以小鼠Hepa 1-6肝癌细胞为免疫原,通过直接免疫法和环磷酰胺免疫消减法两种不同的免疫策略,筛选抗小鼠Hepa 1-6肝癌特异性单克隆抗体。通过直接免疫法我们共获得8株IgM亚型的鼠肝癌特异性单克隆抗体,通过免疫消减法我们共获得24株IgG亚型的鼠肝癌特异性单克隆抗体。通过流式细胞术和免疫荧光法,我们分别评估IgM和IgG亚型鼠肝癌特异性单克隆抗体与小鼠Hepa 1-6肝癌细胞的反应性和特异性,并确认这些抗体与细胞膜蛋白结合。为评估抗体的抗肿瘤活性,我们在C57BL/6免疫鼠上建立了小鼠Hepa 1-6异位瘤模型,结果显示仅IgG亚型抗体(2G2和12D9)具有抗肿瘤活性。2G2和12D9不仅能够预防小鼠Hepa 1-6肝癌形成,还能治疗并完全清除小鼠Hepa 1-6肝癌。此外,我们还在免疫缺陷小鼠(裸鼠和NOD-SCID小鼠)荷瘤模型中证实2G2和12D9的抗肿瘤效果。最后利用免疫共沉淀和飞行时间质谱等方法我们初步筛选并鉴定了 2G2和12D9在细胞膜上的靶向作用分子——氯离子通道蛋白1 CLIC1)。结果表明鼠肝癌特异性单克隆抗体的抑瘤活力可能与干扰CLICI信号通路相关,但具体分子机制有待进一步研究。综上内容,本研究筛选获得32株特异性针对小鼠Hepa 1-6肝癌细胞的单克隆抗体,其中IgG亚型抗体在小鼠荷瘤模型中具有显著的抗肿瘤活性。此外,我们还对这些单克隆抗体的作用靶点进行了初步的探索,初步确定为CLIC1分子。本研究对肝癌治疗靶标筛选策略的改进具有重要指导价值,并为以CLIC1为治疗新靶标的干预治疗模式提供了基础依据。
【图文】：

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【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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