胸苷酸合成酶调控上皮间质转化促进胰腺癌转移的实验研究

发布时间：2020-04-20 20:55

【摘要】：背景:胰腺癌恶性程度高且预后极差,尽管根治性手术是最有效的治疗方式,但是由于确诊时多数胰腺癌患者已伴随远处转移或局部侵犯,因此手术可切除率低。尽管肿瘤生物学在近年获得了极大的进展,但是胰腺癌转移的具体机制尚不明确,因此深入分析胰腺癌发生发展的病理特点,并进行相关的分子机制研究以研发新的诊疗手段是目前胰腺癌基础研究及转化研究的当务之急。胸苷酸合成酶是一种基础代谢酶,在细胞生长增殖过程中起重要作用。抗胸苷酸合成酶策略已经成为一种有效的癌症治疗手段。然而,胸苷酸合成酶对胰腺癌的真正影响仍存在争议。很多研究称TS高表达与癌症不良预后相关,如大肠癌、肺癌、胰腺癌等,但是也有研究提出相反的观点认为TS高表达的胰腺癌患者预后更好。为了进一步揭示TS与胰腺癌的关系,我们系统地评估了胸苷酸合成酶在胰腺癌预后中的价值以及胸苷酸合成酶是否与胰腺癌的转移进展相关。在本项研究中,我们首次将胰腺癌组织样本胞浆和胞核中胸苷酸合成酶的表达分别进行独立的临床意义评估。在发现胰腺癌细胞核中TS高表达与淋巴转移及患者不良预后相关的基础上,我们进一步利用体外实验探索了胸苷酸合成酶对胰腺癌细胞系生物学行为影响,并最终利用两种胰腺癌转移模型验证了胸苷酸合成酶和胰腺癌转移侵袭能力的相关性。方法:从2007年1月至2016年1月间,随机收集91例胰腺癌组织样本(其中71例蜡块包埋组织样本,20例新鲜冰冻样本)及其相对应的正常胰腺组织。整理样本临床资料,利用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)分析新鲜冰冻胰腺癌组织及相应癌旁组织中TS的表达差异;利用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色法对石蜡包埋的胰腺癌组织及相应癌旁组织中TS的表达进行统计并结合临床资料进行临床意义分析。在体外实验中,我们使用含人源性shTS序列慢病毒载体转染PANC-1胰腺癌细胞株,建立TS基因short hairpin RNA(shRNA)稳转胰腺癌细胞株PANC-1-shTS。利用cellcounting kit-8(CCK-8)试剂盒每24小时检测TS对PANC-1细胞生长增殖的影响。利用噻唑蓝(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)检测各种化疗药物对胰腺癌细胞系的影响。此外,我们利用划痕和Transwell法观察PANC-1细胞的运动性能。使用western blot法和细胞免疫荧光检测PANC-1细胞EMT进程中各关键蛋白表达量,为了进一步验证TS对EMT进程的调节,我们检测了 TS缺如对转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)诱导胰腺癌细胞EMT的影响。同时,为了寻找潜在机制,我们使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法检测了胰腺癌细胞裂解产物中TS下游代谢产物脱氧胸苷酸(deoxyadenosine triphosphate,dTMP)的含量,并研究 dTMP 对胰腺癌细胞 EMT的影响。此外,在体内实验中我们使用原位胰腺癌裸鼠转移模型和胰腺癌肺循环转移模型,结合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),计算机断层扫描(computed tomography,CT)和正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)技术系统评估了 TS对胰腺癌侵袭转移的影响,并利用IHC法分析裸鼠胰腺癌转移瘤中细胞增殖指标Ki-67的表达。结果:q-PCR结果显示在20例新鲜冰冻胰腺癌组织样本中共有9例出现了 TS基因表达量显著增高(≥2倍,最高者达到19倍)。同时,western blot结果表明在公认的具有更高恶性生物学行为的胰腺癌细胞株中,TS的表达量也出现了相应增高。IHC分析表明TS广泛分布于胰腺癌肿瘤细胞和癌旁导管上皮细胞的胞浆与胞核中。虽然胰腺癌肿瘤细胞胞浆中TS表达率(p=0.637)与染色强度(p=0.611)并无显著增高,但肿瘤细胞胞浆中TS的表达与周围神经侵犯及肿瘤组织学分级密切相关。卡普兰-迈耶分析也证实,胞浆中TS表达强度低的胰腺癌患者的总生存率虽稍有改善,但是并不具备统计学意义(p=0.84)。但是胰腺癌肿瘤细胞和癌旁导管上皮细胞的胞核中TS的表达不仅在染色率上有明显差异,而且癌组织细胞核中TS的表达量与胰腺癌病理分级(p=0.043)和淋巴转移显著相关(p=0.016)。生存分析则进一步表明肿瘤细胞核中TS的表达与患者总体生存期呈显著负相关(p=0.015)。因此,TS是胰腺癌预后的潜在生物学标记物,而且在胰腺癌恶性进展中发挥着重要作用。体外细胞学实验发现,虽然TS对PACN-1细胞的增殖速度并无明显影响。但TS敲除的胰腺癌细胞对不同浓度吉西他滨(gemcitabine,GEM)的化疗敏感性均显著提升,但是对于5-氟尿嘧淀(5-fluorouracil,5-FU)和厄洛替尼的作用却无明显影响。Transwell实验和划痕试验表明TS的低表达能明显削弱PANC-1细胞的侵袭和迁移能力。Western blot实验显示在PANC-1-shTS细胞株中,上皮标志物E-cadherin蛋白表达增加,而EMT进程中涉及的转录因子,如Snail,Vimentin和ZEB-1表达量均下降。而β-catenin作为EMT中标志性的核转位蛋白,在PANC-1-shTS细胞的胞浆和胞核中表达量均降低。细胞免疫荧光实验显示在PANC-1-shTS细胞中,细胞膜上E-cadherin表达增加,细胞浆中β-catenin重新分布,相应地,胞浆中Vimentin表达降低。除此之外,westernblot和细胞免疫荧光实验均表明TGF-β作用后引起的β-catenin核转位增多和Vimentin过表达现象在PANC-1-shTS细胞中均被弱化。HPLC结果表明在dTMP在PANC-1野生型(wildtype,WT)和 PANC-1-shcontrol 中表达量相近,而在 PANC-1-shTS 细胞中,dTMP含量显著减少。Western blot实验显示,10OμM dTMP作用于胰腺癌细胞株24小时后,E-cadherin几乎不表达,而相对地,Snail,Vimentin,ZEB-1的表达量均显著增加,这一现象在PANC-1-shTS细胞中同样被观察到。在体内实验小鼠胰腺癌转移模型中,影像学检测结果表明,sh-TS实验组中原位胰腺肿瘤的生长被抑制且肝内转移灶数量显著减少,同时生存分析结果表明低表达TS可显著改善荷瘤裸鼠的总生存率。在胰腺癌裸鼠肺循环转移模型中,影像学检测结果也同样证实低表达TS可明显抑制裸鼠肺脏内胰腺癌转移灶的形成。最后,免疫组化分析结果表明,肝脏和肺脏的转移瘤中,TS敲除能显著降低Ki-67的表达。结论:临床样本免疫组化分析显示胰腺癌肿瘤细胞核中TS高表达可能与淋巴转移相关,并提示预后不良。体外研究显示PDACs中TS基础表达量和GEM耐药程度正相关,而sh-TS可显著提高GEM对胰腺癌细胞作用的敏感性,并抑制胰腺癌细胞株的侵袭和迁移能力。后续机制研究提示,TS通过下游产物dTMP影响dNTP池的平衡可能是其调控胰腺癌EMT相关侵袭迁移能力的潜在机制。sh-TS不仅同时抑制原位胰腺癌转移动物模型和肺循环转移动物模型中胰腺癌的远处转移能力,且可显著改善荷瘤裸鼠的总生存率。而免疫组化则证实细胞增殖指标Ki-67在sh-TS组转移灶内也出现了显著下调。
【图文】：

差异分析,胰腺癌,蛋白,蜡块组织

我们提取２０例新鲜冰冻胰腺癌及相对应的癌旁组织样本中ＲＮＡ，并进行逡逑ｑ－ＰＣＲ分析，结果显示，在部分胰腺癌组织４５％邋（９／２０）中ＴＳ基因的表达量高于逡逑其对应癌旁组织２倍以上，差异最大者达到１９倍（图１．１）。逡逑２２１逡逑ｉ２0－逦？逦？逡逑ｃ邋１８－逡逑？２邋１ｆｉ邋？逡逑８邋１６＿逡逑￡邋１４－逡逑ｘ邋１２－逡逑Ｉ邋１０－逦？逡逑Ｑ）邋８－逡逑＾邋６－邋？邋？逡逑１邋４－邋？逡逑0邋｜卞邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣邋丨令卞邋１邋￣￣Ｉ－－１邋Ｉ邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋Ｉ邋１邋，逡逑ｔ－ｃｎｃｏ邋对逦①卜邋000＞0逡逑ＣＭ逡逑图１．１胰腺癌组织与相对应癌旁组织中ＴＳ基因总体表达量差异分析图逡逑？逦鉴于ｑ－ＰＣＲ分析仅能反应ＴＳ在基因水平上的表达情况，而ＴＳ蛋白才是在体逡逑内发挥功能的活性物质。因此，我们利用ＩＨＣ染色法进一步分析ＴＳ蛋白在胰腺癌逡逑及癌旁组织中的定位及表达情况。逡逑我们对７１例胰腺癌及癌旁蜡块组织样本进行免疫俎化染色，结果表明，ＴＳ逡逑蛋白在不同分化程度的胰腺癌组织中普遍表达（图１．１），且广泛分布于胰腺癌组逡逑织和癌旁组织的细胞浆与细胞核中（图１．２）。结合上述ｑ－ＰＣＲ结果，我们推测逡逑ＴＳ在癌组织和正常组织中均有表达，在细胞增殖过程不可或缺，而ＴＳ的异常表逡逑达可能与癌症的发生发展有关。逡逑９逡逑

高分化,低分化,胰腺癌

正文第？部分结果逡逑：＇Ｖ媭⑷．：：．．＼：：Ｋ＇：＇逡逑图１．２邋ＴＳ蛋白（黄褐色颗粒）在胰腺癌组织（Ａ）和癌旁组织（Ｂ）中的染色图逡逑染色图可清晰显示胰腺癌及癌旁组织胞浆和胞核中均有ＴＳ表达（比例尺为５０ｐｍ）逡逑Ａ邋：邋：‘NB邋．邋＇逦＇邋°逦…懰逡逑．＇邋Ａ．＂逦，逡逑图１．３高分化（Ａ）、中分化（Ｂ）、低分化（Ｃ）胰腺癌组织中逡逑ＴＳ蛋白染色的代表性图片逡逑１．３．２邋ＴＳ在胰腺癌及癌旁组织细胞浆中的表达及其临床意义逡逑为进一步揭示ＴＳ与胰腺癌的关系，我们分别独立研究细胞浆和细胞核中ＴＳ逡逑的表达及相关临床意义。首先我们分析ＴＳ在胰腺癌肿瘤细胞和癌旁导管上皮细胞逡逑浆中的表达差异，再结合临床资料分析胰腺癌细胞浆中ＴＳ的表达与临床病理特征逡逑之间的关系。逡逑１．３．２．１邋ＴＳ在胰腺癌肿瘤细胞浆和癌旁导管上皮细胞胞浆中的表达差异逡逑我们对７１例蜡块包埋胰腺癌及癌旁组织的细胞胞浆中ＴＳ蛋白表达情况进行逡逑ＩＨＣ染色分析，结果显示在７１例胰腺癌细胞胞浆中ＴＳ的免疫组化染色结果中，逡逑５９例ＴＳ蛋白表达阳性，１２例表达阴性；在相对应的癌旁组织中，６２例ＴＳ蛋白逡逑表达阳性，９例表达阴性，，卡方检验分析结果显示ｐ值为０．６３７，不具备统计学意逡逑义。表明胰腺癌与癌旁组织细胞浆中ＴＳ的染色率无显著差异（表１．１）。逡逑１０逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

【参考文献】