SHP2酪氨酸磷酸酶在甲状腺癌中表达意义及SHP2靶向超声造影剂在甲状腺癌早期诊断中的应用研究

发布时间：2020-04-22 02:30

【摘要】：【研究背景】甲状腺肿瘤目前发病率呈上升和年轻化趋势,由于发病机制不明,使甲状腺癌早期诊断成为临床亟待解决的难题。筛选新的肿瘤发生相关基因的分子标记物,开发具有肿瘤靶向性的高分子造影剂,对甲状腺肿瘤早期诊断意义重大。SHP-2是目前研究证实的一种致癌基因,属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。SHP-2可以在多种细胞信号传导途径中发挥作用,促进了肿瘤的发生发展。近年来不断有研究报道,在多种实体肿瘤中SHP-2表达水平也是明显增高的,并促进了肿瘤的恶性生物学行为;本研究拟合成靶向纳米造影剂,以期建立活体评估甲状腺癌的影像评价体系,争取实现甲状腺肿瘤的早期准确诊断。主要研究内容如下:第一部分SHP2在甲状腺癌中表达及其对甲状腺癌细胞恶性生物学行为的影响【研究目的】通过检测SHP2在甲状腺癌组织及细胞株中的表达水平,探讨SHP2过表达在甲状腺癌中的临床意义及对甲状腺癌细胞生物学行为的影响。【研究方法】本研究采用western和免疫组织化学技术检测了SHP2在甲状腺癌组织、癌旁组组及甲状腺正常组织中的表达情况;检测SHP-2表达抑制后对甲状腺癌细胞生长、克隆形成能力和抗凋亡的影响。【研究结果】检测了甲状腺癌组织、癌旁组组及甲状腺正常组织中SHP2的表达水平,发现相对于其它两组,SHP2在甲状腺癌组织中表达明显升高,且SHP2的表达水平与TNM分期及淋巴结转移密切相关(P0.05)。另外,相对于正常甲状腺细胞,SHP2在甲状腺癌细胞株中也是呈高水平表达。SHP2的表达阻滞后,细胞的克隆形成明显减少,凋亡细胞明显增多,说明SHP2高表达增加了细胞的增殖和抗凋亡能力;SHP2表达受到干扰后,裸鼠体内成瘤能力明显受到抑制。【结论】SHP2过表达于甲状腺癌细胞株和甲状腺癌组织中,促进了甲状腺癌细胞增殖和抗凋亡能力,促进了裸鼠体内成瘤能力。第二部分SHP2靶向超声纳米造影剂的制备及表征【研究目的】构建靶向甲状腺癌SHP2的超声分子探针,选用高分子材料聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)为外壳,液态氟碳PFP为内核,检测其物理学等特征。【研究方法】用双乳化溶剂挥发法制备端羧基乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA-COOH)纳米粒,以液态氟碳PFP为内核,在纳米粒表面连接SHP2抗体构建靶向甲状腺癌SHP2的US分子探针,即SHP2-PLGA纳米粒,同时构建非靶向PLGA纳米粒。利用荧光显微镜、Malvern激光粒径测量仪,对其形态、结构、粒径、电位、吸收光谱和稳定性进行检测;并将制备的乳液置于温度调节板中,设置温度至60度,用光学显微镜于高倍视野下观察制备的乳液在温度升高后发生的变化。【研究结果】成功构建了靶向甲状腺癌SHP2的US分子探针,其形态规则、呈球形,粒径(765.0±12.5)nm,大小、分布均匀,分散性好,无明显聚集,表面凹凸呈多孔结构。经温度调节,在温度升高至40度开始出现直径约1um-5um的微气泡。【结论】成功制备出SHP2靶向超声纳米造影剂,该造影剂形态规则、大小均匀,稳定性高,较低温度就能促进其液-气相变。因此,此造影剂可实现US靶向显像及温度相变功能,可能会具有增强超声显像潜能。第三部分SHP2靶向超声纳米造影剂的生物相容性研究【研究目的】研究评价SHP2靶向造影剂生物相容性,为其进一步临床研究和转化提供了实验基础。【研究方法】采用MTS等方法检测靶向造影剂体外细胞毒性;采用LD50评价其在小鼠腹腔注射后短期体内毒性。【研究结果】MTS实验表明SHP2靶向超声纳米造影剂对甲状腺细胞没有明显的毒副作用;Countess观察造影剂对细胞存活率及死亡率没有影响;LD50检测靶向造影剂具有较广的安全范围;Western-Blot检测甲状腺癌细胞Caspase-3、BAX、Bcl-2表达,表明纳米造影剂具有很好的生物安全性。【结论】SHP2靶向超声造影剂具有很好的生物安全性,可进一步用于肿瘤的诊断。第四部分SHP2靶向超声纳米造影剂在甲状腺癌早期诊断中的应用【研究目的】(1)体外细胞实验:测试造影剂的靶向结合效率,超声体外显影强度。(2)动物实验:通过超声活体成像检测靶向造影剂在裸鼠体内的寻靶能力,探讨甲状腺癌的超声早期靶向显像的可行性。【研究方法】将试验分为两组分别进行,靶向组:NPs-SHP2,非靶向组:NPs-Control,观察两组造影剂的体外细胞靶向性;将靶向造影剂经尾静脉注射到模型动物体内经低强度聚焦超声(low intensity focused ultrasound,LIFU)仪辐照后,用US观察裸鼠体内成像能力。多组均数间用方差分析进行比较,组内两均数间用LSD-t检验进行比较。【研究结果】体外寻靶实验显示,靶向组造影剂组细胞周围有更多的纳米球聚集。裸鼠体内靶向成像发现,经LIFU照射20min后,相对于非靶向组,靶向组超声信号明显增强。【结论】本研究为SHP2靶向超声造影剂应用于甲状腺癌早期准确诊断提供了实验基础。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R736.1

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本文编号：2636029