核酸循环光电信号放大的纸微流控检测肿瘤相关小肽

发布时间：2020-04-24 04:14

【摘要】：近几年来,癌症的发病率和死亡率来呈现逐渐升高的趋势,在早期检测和治疗中能够快速、灵敏地检测肿瘤标记物具有重要意义。作为人体内蛋白质水解后的产物,小肽在氨基酸的消化、吸收等方面起到重要的作用。癌变过程发生后,癌细胞的新陈代谢与正常细胞会有很大的不同,癌细胞也会产生小肽类物质。因此,通过检测肿瘤相关小肽的含量水平,人们能够能及时发现癌症,从而达到疾病早期预警的目的。以杂交链反应技术为代表的核酸循环放大方法由于具有反应条件简单温和且信号放大效率高而备受关注。纸微流控以普通的色谱纸为基体材料,具有成本低廉、制作简单和生物相容性好等优点。因此,将有效的核酸循环光电信号放大体系引入到微流控纸芯片上,构建高灵敏的生物传感器检测肿瘤相关小肽对于降低检测成本、提高检测灵敏度等具有重要意义。本论文分为以下几部分:1.对核酸循环放大方法进行初步研究,设计了一种简单、快速地检测肿瘤相关小肽mucins-1(MUC1)的方法,将适配体的特异性识别、氧化石墨烯的猝灭荧光效应和核酸循环放大策略结合在了一个实验体系内。适配体不仅能够与目标小肽进行特异性识别而且适配体上的引发序列能够进一步引发发卡探针之间的杂交链反应。通过氧化石墨烯的吸附、富集作用,杂交链反应的反应时间大大缩短,减少了分析检测时间。氧化石墨烯对荧光的猝灭作用使得背景信号大大降低,从而极大地提高了检测的灵敏度。2.将高效率的核酸循环放大体系与低成本的纸微流控相结合,设计并构建了一种灵敏检测肿瘤相关小肽MUC1的纸基传感器。目标小肽的存在会使得引发序列与适配体分离,从而两个发卡探针之间的杂交链反应在传感表面形成长链DNA,成功地将目标物的检测转化为放大后的长链DNA的定量。大量电化学发光探针嵌入到长链DNA后,电化学发光信号就间接地与目标小肽的含量建立定量关系,从而实现肿瘤相关小肽的灵敏检测。3.将纸微流控与DNA链置换为基础的核酸循环放大技术相结合,成功地把金属离子电化学标记和钌的配合物电子线引入到检测体系中来,设计并构建了一种能同时检测两种目标物的电化学适配体传感。目标物的特异性识别是基于目标物与适配体之间的亲和力大于适配体与其互补序列之间的亲和力这一实验事实为基础实现的;信号的转换与放大通过金/牛血清白蛋纳米球负载大量的金属离子电化学标记和两种金属离子各自的特异性电化学检测峰来实现;检测体系的灵敏度得益于将钌的配合物引入检测体系形成电子线从而减少了DNA骨架对电子传递的阻力。
【图文】：

示意图,机理,示意图,模板

核酸循环光电信号放大的纸微流控检测肿瘤相关小肽点而被广泛应用于多个领域[25]。RCA 的机理如图 1.1 所示。首先，含NA 模板（Circular Template）在连接酶（Ligase）的作用下与连接模板）相结合。其中，连接模板是一个能将环状 DNA 模板间隙两侧连接料（脱氧核苷三磷 dNTPs 或者三磷酸核苷 NTPs 的混合溶液）存在合酶或者 RNA 聚合酶的连接反应使得 RCA 得以进行，从而形成含有核酸产物。RCA 最终得到的长链核苷酸产物用探针标记后可以进一析物，如 DNA、RNA、小分子、蛋白质甚至是细胞。

示意图,机理,示意图,步骤

济南大学硕士学位论文FIP 和 F3 相同的引物会引发合成步骤，从而生成一个哑铃形的 DNA。合成步骤生成的哑铃形DNA会经过自引物DNA合成快速转换成一个茎环DNA并作为 LAMP反应的起始原料。第二个过程是循环放大步骤。首先，FIP 与上述步骤所得茎环 DNA 的环状结构部分发生杂交反应，进而通过链置换反应来实现 LAMP 循环。这个过程会产生一个带有另一个环的中空茎环DNA。自引物链置换介导的 DNA合成会产生一个间隙修复茎环 DNA和一个长的 DNA 序列，这个长序列与原始茎环 DNA 碱基互补。这些产物为 BIP 的识别和杂交进而引发新的合成过程提供了模板，，而新的合成过程中的一部分就是在后续循环中链的延长和循环步骤。LAMP 最终得到的产物是一个有不同茎长度和菜花状结构的复合茎环 DNA。与传统的 PCR 技术相比，LAMP 所实现的指数扩增在提高检测的灵敏度和扩增效率方面具有更大的优势。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657.3;R730.4

【参考文献】