miR-183对胰腺癌进展及化疗耐药的分子机制研究

发布时间：2020-04-28 13:24

【摘要】：研究背景近年来,胰腺癌的发病率在全球范围内呈逐渐上升趋势,然而总体生存率仍极为低下,往往发生局部晚期或远处转移后才能最终确诊,5年生存率在6%左右,一般来说,50%的病人发现时已经远处转移,30%的病人发现时处于局部晚期,另外仅仅20%的病人发现时才有手术机会,对于大多数病人,根治性手术已无法完成,最近一项研究显示胰腺癌患者R0切除术后联合化疗,5年生存率15-30%,而且尽管术后联合应用吉西他滨或其他辅助化疗,90%术后出现局部复发。吉西他滨耐药是目前胰腺癌治疗的重点以及难点,因此,阐明胰腺癌吉西他滨化疗耐药性的相关机制至关重要,目前已有多项研究提示胰腺癌化疗耐药涉及多种机制,包括异常基因表达、信号通路丢失、上皮-间质转化(EMT)及纤维组织增生等等,然而具体机制仍不明确。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码单链小分子RNA,长约20-25个核苷酸,通过与多个靶基因的mRNA 3’非翻译区不完全互补配对,配对成功后,在转录后水平抑制基因表达。已经证实,miRNAs调控多种生理和病理过程,包括细胞生长、凋亡、细胞周期、分化、代谢和肿瘤发生。研究目的本研究旨在明确miR-183在胰腺癌发生发展及耐药方面的机制。研究方法qRT-PCR方法检测胰腺癌组织及癌旁组织标本以及三种胰腺癌细胞系(PANC-1细胞,AsPC-1细胞,BxPC-3细胞)miR-183的表达水平,然后分析胰腺癌临床病理因素与miR-183表达的关系。构建过表达及沉默表达miR-183质粒,并转染至胰腺癌细胞,观察miR-183对胰腺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期以及对吉西他滨化疗敏感性的影响。裸鼠皮下移植肿瘤模型观察miR-183在体内对肿瘤生长的影响。生物学信息分析预测miR-183的靶基因,并应用双荧光检测体系,qRT-PCR,western blotting方法明确miR-183的靶基因以及进一步分析miR-183与靶基因在信号通路方面的作用机制。研究结果1.miR-183在癌组织较癌旁组织明显升高,miR-183的表达差异与性别、年龄、部位、大小及淋巴结转移均无明显相关性,但与临床分期,肿瘤分化程度有关,我们进一步发现三种胰腺癌细胞系miR-183的表达水平较胰腺正常细胞株细胞均明显升高,具有统计学意义。2.首先我们成功建立过表达及沉默miR-183胰腺癌细胞,并应用MTT及FCM方法检测分别在转染1d,2d,3d及4d细胞增殖数目,发现miR-183过表达慢病毒转染组3天和4天后细胞增殖出现显著上升,而细胞凋亡数目减少,并影响细胞周期G期,转染miR-183 inhibitor至胰腺癌细胞系后,结果则相反,通过裸鼠皮下移植肿瘤模型,我们发现体内研究得出与体外研究类似的结论,miR-183起促癌作用。3.我们加入不同浓度吉西他滨(0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml)加入培养基中,通过使用MTT法检测过表达miR-183及沉默miR-183对不同浓度下吉西他滨在PANC-1及BxPC-3细胞中的化学敏感性的影响,敲降miR-183表达能够提高细胞对于吉西他滨的敏感性。利用miRNA数据库TargetScan对miR-183可能的靶基因进行预测分析发现miR-183与BNIP3L的3’UTR区域有结合位点,为验证BNIP3L是否为miR-183靶基因,我们构建BNIP3L的3’UTR野生型表达载体PLuc-BNIP3L-3’-UTR以及Mut-BNIP3L-3’-UTR的突变载体;荧光素酶报告系统,western blotting结果均显示BNIP3L基因是miR-183的靶基因,进一步发现BNIP3L可逆转miR-183对PI3K/Akt信号通路以及对胰腺癌细胞增殖、细胞周期和化疗敏感性的影响。研究结论1.miR-183在胰腺癌异常表达,且与肿瘤分期及分化有关;2.体内外研究表明miR-183起促癌作用并影响化疗敏感性;3.miR-183通过靶基因BNIP3L介导PI3K/AKT信号通路影响胰腺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及化疗敏感性;4.miR-183是胰腺癌一个新的治疗靶点。
【图文】：

南京医科大学结 果83 在胰腺癌组织及癌旁组织标本中的表达情况采用 RT-PCR 方法检测 35 例胰腺癌组织及癌旁组织标本 miR结果发现 miR-183 在癌组织较癌旁组织均明显升高，差异有.01）（图 1.1），当我们进一步对比在低分化、中分化以及高-183 的表达水平，发现低分化胰腺癌 miR-183 的表达水平最胰腺癌，高分化胰腺癌表达水平最低，差异有统计学意义（83 的表达差异与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及淋巴结转(P>0.05) ，但与临床分期有关（P <0.05）（表 1.1）。

12 2.179±0.3689 F=8.005 P<0.0111 3.298±0.342612 4.083±0.314383 在胰腺癌细胞中的表达情况进一步采用 RT-PCR 技术对 miR-183 在三种胰腺癌细胞系（C-1 细胞，BxPC-3 细胞）与胰腺正常细胞株 HPDE6C-7 细胞测，通过比值测定发现三种胰腺癌细胞系 miR-183 的表达水平 HPDE6C-7 细胞均明显升高，具有统计学意义（P <0.01），癌细胞PANC-1细胞miR-183表达最高，而中分化的胰腺癌细，高分化的胰腺癌细胞 BxPC-3 中表达较弱，差异有统计学意iR-183 与胰腺癌的分化程度有关（P <0.01）（图 1.2）。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

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本文编号：2643514