阿帕替尼抗胆道肿瘤细胞作用及机制研究

发布时间：2020-05-05 11:00

【摘要】：背景和目的:胆道癌(biliary tract cancer,BTC)是一组罕见于胆道系统的异质性肿瘤,可分为胆囊癌(GallbladderNeoplasms)、肝内胆管癌(iCCA)、肝门部胆管癌(pCCA)、远端胆管癌(dCCA)。在实际临床工作中,该类疾病确诊时分期较晚,5年生存率小于5%,外科手术是胆道癌可能获得治愈的唯一治疗方法,但可接受手术切除机会的患者不超过1/3,进展期胆道癌患者的主要治疗手段是系统化疗,NCCN推荐顺铂联合吉西他滨为一线化疗方案,但疗效差、生存期短。胆道癌目前无合适靶向治疗药物,阿帕替尼作为一种靶向VEGFR-2的小分子TKI,也可抑制c-Kit,Ret,PDGFR-β,以及c-src等酪氨酸激酶,CFDA于2014年12月批准阿帕替尼可用于晚期胃腺癌或胃-食管结合部腺癌三线以上的治疗,也发现在乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌等肿瘤效果明显,因此进一步探索胆道癌的发病机制,寻求靶向治疗具有深远意义。前期临床研究发现两例治疗后进展的胆道癌患者经阿帕替尼治疗后,PFS6个月,显示了阿帕替尼对胆道癌可喜的临床疗效。本实验拟通过MTT试验、流式试验、划痕试验、transwell试验、克隆形成试验探讨阿帕替尼对胆道肿瘤细胞系增殖、凋亡、迁移、侵袭及集落形成影响。通过Western blot初步检测信号通路蛋白水平变化,分析可能作用的信号通路。希望为体内试验、临床试验提供理论基础,为胆道肿瘤患者提供新的治疗手段。方法:1.人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞经不同浓度阿帕替尼处理后,分别通过MTT、流式细胞术、Transwell侵袭试验、划痕试验、平板克隆形成试验分析胆道肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和集落形成能力;2.通过western blot试验检测经不同浓度阿帕替尼处理后VEGFR2-RAS-RAF-MEK-ERK 通路、p-src、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶、凋亡调节蛋白等相关蛋白表达变化。结果:1.人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞在1-5d内随时间延长,增殖率均增加,阿帕替尼可抑制其增殖,呈浓度依赖性,随阿帕替尼浓度升高,抑制作用增强;2.阿帕替尼可促进人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、RBE细胞凋亡,呈浓度依赖性,随阿帕替尼浓度升高,促凋亡作用均增加,但对胆管癌细胞Hccc-9810促凋亡作用不明显;3.阿帕替尼可抑制人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞侵袭、迁移,呈浓度依赖性,随阿帕替尼浓度升高,抑制作用增加;4.阿帕替尼减少人胆道肿瘤细胞系集落形成,呈浓度依赖性,随着阿帕替尼浓度升高,抑制作用增强;5.阿帕替尼可下调人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞p-VEGFR2表达,进而下调下游的信号p-ERK1/2、k-ras表达,呈浓度依赖性,随着阿帕替尼浓度的增加,抑制作用增强,阿帕替尼通过VEGFR2-RAS-RAF-MEK-ERK途径抑制增殖。6.人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞存在p-src表达。阿帕替尼可上调E-钙粘蛋白,下调p-src、基质金属蛋白酶,呈浓度依赖性,随阿帕替尼浓度升高,抑制作用增强。表明阿帕替尼可通过靶向p-src后调节E-钙粘蛋白及基质金属蛋白酶的表达量,最终达到抑制肿瘤侵袭、迁移。7.阿帕替尼可上调人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞促凋亡蛋白p21、Bax、caspase3,下调抗凋亡蛋白Bcl-2,呈浓度依赖性,p53蛋白水平无明显改变。结论:阿帕替尼可抑制人胆道肿瘤细胞系GBC-SD、Hccc-9810、RBE细胞增殖、侵袭、迁移、集落形成,促进凋亡,可通过VEGFR-2/K-ras/RAF/MEK/ERK途径抑制增殖,通过上调促凋亡蛋白p21、Bax、caspase3,下调抗凋亡蛋白Bcl-2达到促凋亡作用,通过上调E-钙粘蛋白、下调基质金属蛋白酶抑制侵袭、迁移。
【图文】：

细胞系,浓度梯度,浓度,致死浓度

结果逡逑３．邋１阿帕替尼对胆道肿瘤细胞增殖的半抑制率（ＩＣ５０）测定逡逑以ＭＴＴ法检测ＩＣ５０，每次试验设置３个平行组，重复４次，，阿帕替尼处理逡逑细胞２４ｈ，结果显示阿帕替尼诱导胆道肿瘤细胞ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ半逡逑致死浓度分别为邋４０．邋９±１．邋９７＾ｉＭ、６７．邋７４±２．邋５３）ａＭ、５３．邋３６±２．邋８８｜＿ｉＭ邋（图邋３－１）。三逡逑个细胞系对阿帕替尼的敏感程度由强到弱分别为ＧＢＣ－ＳＤ、ＲＢＥ、Ｈｃｃｃ－９８１０。根逡逑据此结果设定浓度梯度，以接近ＩＣ５０浓度为最高浓度，设置４个浓度梯度，设逡逑定阿帕替尼作用于ＧＢＣ－ＳＤ的浓度梯度为ＯｕＭ、１０ｕＭ、２０ｕＭ、４０ｕＭ；阿帕替逡逑尼作用于Ｈｃｃｃ－９８１０的浓度梯度为ＯｕＭ、１５ｕＭ、３０ｕＭ、６０ｕＭ；阿帕替尼作用于逡逑ＲＢＥ邋的浓度梯度为邋ＯｕＭ、１２．邋５ｕＭ、２５ｕＭ、５０ｕＭ。逡逑不同细胞系ＩＣ５０逡逑

呈现时间,浓度依赖性,细胞增殖,凋亡

后四个死亡细胞、晚期凋亡细胞、正常阴性细胞、早期凋亡细胞所占比率。逡逑表３－２－４表示不同浓度阿帕替尼作用于ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ后凋亡百逡逑分比的变化。图３－３示阿帕替尼促进胆道肿瘤ＧＢＣ－ＳＤ、Ｈｃｃｃ－９８１０、ＲＢＥ细逡逑胞凋亡
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.8

【参考文献】