肿瘤特异超级增强子PLAU-SE及其组分的鉴定和功能研究

发布时间：2020-05-08 12:59

【摘要】：超级增强子(super enhancer,SE)是具有强大活性增强子的一个大簇,通常含有数个组分增强子区域,较普通增强子体量更大且更能驱动控制细胞身份基因等重要基因的表达,进化上趋向于存于与发育相关的重要基因附近,通常在20kbp以内,且有CTCF区域形成环状结构以限制其增强功能作用于特定靶基因,在发育和肿瘤等疾病发生过程中起到重要作用。通过生物信息学的方法,本课题在多种肿瘤细胞系中筛选出以H3K27ac和H3K4me1的高水平组蛋白修饰为首要标志,辅以CTCF成环预测,鉴别出多个潜在的肿瘤特异性超级增强子。随后我们通过CRISPR-CAS9基因编辑技术敲除了位于PLAU基因上游的超级增强子片段,随即发现敲除该片段特异性降低PLAU(u-pa)的表达,并引起了Hela细胞的一系列生理特性变化,包括增殖率降低,迁移及侵袭性明显下降,对胞外基质的亲和力上升,对顺铂的敏感度上升等。通过CRISRPCas9技术,进一步明确了该超级增强子的组分位置及各个组分的活性强度,在获得敲除最高转录活性区域的细胞系后,后续的裸鼠成瘤及肿瘤染色均表明该区域的缺失会降低Hela细胞在体内的恶性程度并使肿瘤细胞对顺铂的敏感度增加,提示该区域是一个潜在的抗肿瘤靶向区域。最后,通过染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法检测了Hela细胞在低氧和顺铂处理情况下该超级增强子的活性变化,发现低氧条件(5%O2,36h)诱导该超级增强子活性提高,而顺铂处理(4μg/ml,48h)使该区域活性降低,提示低氧条件可能部分通过活化超级增强子来增加肿瘤细胞的恶性程度,顺铂则可能部分通过降低超级增强子的活性来抑制肿瘤细胞的恶性生长。结论:人宫颈癌细胞通过特异性激活超级增强子PLAU-SE提高细胞增殖、迁移、侵袭及耐药能力,且低氧刺激会加强PLAU-SE的活性。PLAU-SE敲除会降低上述细胞恶性表现,是一个有潜在应用价值的靶向位点。
【图文】：

增强子,结合模式

1.2.1 SE 的定义通过在全基因组水平的生物信息学分析，Young 等人通过分析 Key-TFS（关键转录因子）和中间复合体的结合点，在小鼠 ES 细胞内首次提出了超级增强子的概念，即一串具有强大促转录功能的增强子集合。利用高通量染色质免疫互作结果，Young 等人分析了与控制细胞分化方向密切相关的数个关键转录因子的共同结合位点，根据其所在位置共鉴定出了 8800 个增强子区域，而在这 8800 个增强子区域内，有 231 个增强子与转录中间复合体的结合密度远高于剩余增强子。后续的分析结果发现，这些具有同中间复合体高密度结合的增强子还存在以下特性，即：高水平的组蛋白修饰（H3K27ac，H3K4me1），高水平的染色质修饰（p300），和高水平的 DNaseI Hypersensitivity Clusters 集合。超级增强子与中间复合体的结合模式如图 1-1 所示。具有这些特质的增强子在结构上常常与控制细胞分化状态和分化方向的重要基因相关联，为了表明这一类增强子的特殊性，Young 等人将其称为超级增强子（SE）[6-8]。

流程图,增强子,流程图

哈尔滨工业大学理学硕士学论文的的几个关键转录因子结合区域进行高通量染色质免疫互作测序分析，在获得序列后，挑选出其共同结合区域分析，若这些与关键转录因子结合的增强子区域在基因组水平上临近（间距小于 12.5kb），则拼接为一个增强子串，，接着分析增强子串和单一增强子与中间复合体的结合水平，依照其强度绘制曲线图，人为划定曲线斜率高于 1 的为超级增强子，低于 1 的为普通增强子。由于-2 为生物信息学方法鉴定超级增强子的流程图。由于超级增强子在不同细胞、不同时期内激活状态呈现显著差异，且不同重要基因所需要的关键转录因子各不相同，在无法得知某一重要基因最需要的关键转录因子是什么时，这种方法并不适用[13-19]，鉴于此，Abranham等人通过生物信息学分析，发现在增强子共有的分子标识中，H3K27ac 为置信度最高的标志。利用 H3K27ac 的丰度，联合考虑增强子体量，可较为准确地初筛超级增强子[6-8]。本实验室的刘洪波博士已于前期构建了基于体量和各分子标记丰度预测多个细胞系内特异性活化的超级增强子的方法和网站 SEA，其结果发表于NAR 上[20]
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;R73

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