CCDC34在胰腺癌血管生成中的作用及其预后意义

发布时间：2020-05-08 20:01

【摘要】：胰腺癌(Pancreatic adenocarcinoma,PAC)发病隐匿,进展迅速,治疗效果和预后极差,发病率和死亡率呈平行增长趋势。目前认为胰腺癌是一种多因素疾病,是癌细胞、微环境与机体(包括遗传、代谢、免疫等)相互作用的复杂过程。虽然对胰腺癌的流行病学、发病机制和诊断治疗有了更深的认识,但各种治疗方法的效果有限,主要是由于胰腺的特殊性、早期发现和手术切除的困难、化疗效果不佳。近30年来,胰腺癌形成的分子机制研究、生物靶向治疗、机体内药物转运的改善以及免疫系统的调控发展迅速。然而,KRAS的研究并未取得显著的效果,恢复TP53等抑制基因也难以实现,靶向治疗疗效仍不尽人意。针对人类胰腺癌的治疗仍然是一个很大的挑战。因此,针对胰腺癌的发病机制、早期诊断、药物筛选、治疗策略及预测复发转移方向的探索已然成为当今的热点研究方向之一。卷曲螺旋结构域蛋白 34(Coiled-coil domain containing 34,CCDC34)是一种可以编码蛋白的疾病相关基因,也被称为NY-REN-41、RAMA3或L15。近期,陆续有研究发现CCDC34在数种恶性肿瘤中呈高表达水平,包括肾细胞癌、非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)和膀胱癌,并且与肿瘤的增殖、凋亡及血管生成等有关。本课题组近期采用生物信息学的方法对癌症公共数据库Oncomine和TCGA数据进行预测分析:与正常对照组相比,CCDC34 mRNA在胰腺癌中显著高表达,并且高表达的CCDC34mRNA与血管生成相关指标(VEGF、CD31等)显著相关,因此在研究中,我们重点验证及探索CCDC34在胰腺癌血管生成中的作用及其临床预后意义,以期为寻找胰腺癌治疗的新靶点、新策略提供理论依据。第一部分CCDC34在胰腺癌中的表达水平及其临床预后意义目的:近期有研究发现CCDC34具有促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移的特点。本研究旨在比较胰腺癌与正常胰腺组织中CCDC34的表达差异,并探索CCDC34的表达水平在胰腺癌患者中的预后意义。方法:首先利用Oncomine和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库初步预测CCDC34的表达和预后价值;而后采用免疫组织化学染色的方法检测胰腺腺癌组织样品(N =90)和配对的癌旁胰腺组织(N =90)中CCDC34蛋白的表达水平;最后,分别应用Kaplan-Meier单因素生存分析和Cox多因素生存分析探索CCDC34表达水平在胰腺癌中的预后价值。结果:Oncomine和TCGA数据库预测发现:与正常胰腺组织相比,胰腺癌组织中CCDC34 mRNA表达水平显著升高(P0.05),且CCDC34 mRNA表达水平升高的胰腺癌患者总生存期显著低于正常对照组(P=0.031)。免疫组化显示:与配对的癌旁组织相比,胰腺癌组织中CCDC34蛋白的表达水平显著增高(P=0.000),并且高表达CCDC34的胰腺癌患者总生存期比CCDC34低表达的胰腺癌患者总生存期显著降低(P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析和Cox多因素生存分析证实:CCDC34高表达水平是胰腺癌患者预后不良的独立预测因子(P值均=0.000)。结论:CCDC34在胰腺癌中显著高表达,并且高表达的CCDC34是预测胰腺癌患者预后不良的独立预测因素。第二部分CCDC34与胰腺癌血管生成指标的关系及潜在机制研究目的:在第一部分研究结果的基础上,进一步探讨和验证CCDC34与胰腺癌血管生成的关系及其可能机制。方法:首先下载TCGA数据库中的胰腺癌数据,分析CCDC34和PI3K/AKT信号通路中的关键分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA和 PECAM1)mRNA表达水平及其相互关系。随后,采用免疫组化的方法在胰腺癌标本中检测上述指标的蛋白表达水平,并分析CCDC34表达与上述指标的相关性。最后利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot方法检测PI3K/AKT信号通路中关键分子的mRNA和蛋白表达水平。结果:生物信息学预测结果显示:与正常对照组相比,胰腺癌中CCDC34基因和 PI3K/AKT 信号通路关键分子(PIK3CA、AKTI、mTOR、HIF1A、VEGFA和PECAM1)的mRNA表达水平显著升高(P值均0.05)。随后的免疫组化检测数据与预测结果一致。同时,生物信息学结果显示:胰腺癌中CCDC34和PI3K/AKT通路的关键分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA 和 PECAM1)呈显著正相关,相关系数分别为:CCDC34与PIK3CA(R=0.24,P=0.0012)、CCDC34与 AKT1(R=0.29,P =6.6e-05)、CCDC34 与 mTOR(R =0.24,P =0.0015)、CCDC34与 HIF1A(=0.15,P =0.041)、CCDC34 与 VEGFA(R =0· 19,P =0.011)及 CCDC34与PECAM1(R=0.17,P=0.026)。随后的免疫组化结果显示:CCDC34与VEGF及MVD计数均呈显著正相关,相关系数分别为0.464和0.378(P值均为0.000);CCDC34高表达组的MVD值显著高于CCDC34低表达组(P0.001)。此外,qRT-PCR和Western blot验证了 CCDC34的高表达可能通过激活PI3K/AKT途径促成胰腺癌的血管生成。结论:胰腺癌中CCDC34与PI3K/AKT通路中的关键分子(PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A、VEGFA和PECAM1)的表达呈正相关,提示高表达的CCDC34可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进胰腺癌的血管生成。第三部分CCDC34对胰腺癌细胞功能学作用的影响及分子机制目的:在前两部分的基础上,进一步探讨CCDC34对胰腺癌细胞功能学作用的影响及分子机制。方法:我们选择3株胰腺癌细胞株(BxPC-3、PANC-1和SW1990)和1株正常胰腺导管细胞株HPDE6-C7,分别检测CCDC34在上述细胞株中的基础表达量;然后选择表达量最高的PANC-1作为工具细胞株,利用RNA干扰技术对PANC-1中的CCDC34进行沉默,而后行细胞增殖、细胞周期、凋亡、克隆形成及血管形成功能学实验;利用全基因组表达谱筛选技术对沉默与未沉默CCDC34的PANC-1细胞株筛选差异表达基因,采用DAVID网站进行KEGG通路富集分析,western blot方法对通路关键分子进行了相关验证。结果:与对照组比较,CCDC34沉默组的胰腺癌细胞增殖和克隆形成数量明显减少,细胞周期被阻滞在G2/M期,凋亡细胞数明显增多,血管形成能力明显减弱(P值均0.001)。其次,全基因表达谱分析显示:沉默CCDC34后总共有410个基因发生了显著的表达变化(P值均0.05),其中有218个基因上调,192个基因下调。随后,David在线工具富集显示:在排名前10位的富集通路中,PI3K/AKT信号通路富集最为显著。最后,western blot实验证实:沉默CCDC34后PI3K及AKT水平变化不显著,而p-PI3K和p-AKT水平明显减低。结论:沉默CCDC34可显著抑制胰腺癌细胞的增殖、克隆形成及血管生成,促进其细胞凋亡,其机制可能与CCDC34对PI3K/AKT信号通路的调控有关。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9

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