前列腺癌中环状RNA的表达谱及其初步应用研究

发布时间：2020-05-15 01:43

【摘要】：第一部分前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA的表达谱目的:(1)通过高通量转录组测序的方法获取前列腺癌相关细胞系及组织中环状RNA(circRNAs)的表达谱。(2)筛选出前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达的circRNAs。(3)对差异表达的circRNAs进行功能预测及分析。方法:选择3种前列腺癌相关细胞系(正常前列腺上皮细胞系RWPE-1、前列腺癌原发灶细胞系22RV1、前列腺癌骨转移细胞系PC-3)及65对前列腺癌与癌旁组织,进行高通量转录组测序,并结合生物信息学方法综合分析。结果:(1)3种前列腺癌相关细胞系中共识别出9,545个circRNAs,其中845个circRNAs在3种细胞系中均有表达,同时还发现了大量差异表达的circRNAs。GO功能分析和KEGG通路分析提示这些差异表达circRNAs的宿主基因具有重要的生物学功能并在许多重要的分子信号通路中发挥关键作用。(2)采用DCC、find_circ和circRNA_finder这三种算法在65对前列腺癌与癌旁组织中共识别出277,122个circRNAs,其中三种算法共同识别出的circRNAs有82,797个。非监督聚类和PCA分析提示前列腺癌与癌旁组织中circRNAs的表达谱存在明显差异,其中有9个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著上调,86个circRNAs在前列腺癌组织中表达显著下调。对这95个差异表达的circRNAs进行功能预测提示其与相应的miRNAs具有多个结合位点。结论:(1)circRNAs在前列腺癌相关细胞系及组织中均广泛存在,而且不同细胞系及组织之间具有显著表达差异;(2)生物信息学分析显示,前列腺癌中差异表达的circRNAs可能通过竞争性吸附miRNAs发挥相应生物学功能,或与其宿主基因一起参与前列腺癌的疾病进展,并可能具有潜在的诊断应用价值。第二部分前列腺癌中差异表达环状RNA的验证及作用研究目的:(1)对前列腺癌相关细胞系及组织中circRNAs的测序结果进行验证。(2)结合细胞系测序及验证结果分析环状RNA-circFUT8在前列腺癌相关细胞系中的表达差异及意义;(3)结合组织测序及验证结果探讨环状RNA-circAMACR在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。方法:(1)选择测序结果中部分差异表达的circRNAs,采用qRT-PCR的方法分别在正常前列腺上皮细胞系与前列腺癌细胞系、前列腺癌与癌旁组织中对其进行表达量验证。(2)结合细胞系测序结果选择circFUT8(在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1中低丰度表达,在前列腺癌原发灶细胞系22RV1和前列腺癌骨转移细胞系PC-3中表达逐渐升高)为研究对象,对其在前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并结合其宿主基因功能,分析circFUT8在前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化过程中的作用及意义。(3)结合组织测序结果选择circAMACR(在前列腺癌组织中表达上调最为显著,fold change=6.19,P=1×10~(-13))为研究对象,对其在前列腺癌组织与癌旁组织、前列腺癌细胞系与正常前列腺上皮细胞系中的表达差异进行qRT-PCR验证,并通过siRNA干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨其在前列腺癌诊断及进展过程中的作用及意义。结果:(1)前列腺癌相关细胞系及组织中差异表达circRNAs的qRT-PCR验证结果与测序结果基本一致。(2)circFUT8在前列腺癌细胞系中的表达显著高于正常前列腺上皮细胞系,在前列腺癌转移细胞系(PC-3、DU145)中的表达显著高于前列腺癌原发灶细胞系(22RV1),在雄激素非依赖性前列腺癌细胞系(PC-3、DU145)中的表达也显著高于雄激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCap)。(3)circAMACR在前列腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,在前列腺癌细胞系中的表达也显著高于正常前列腺上皮细胞系。circAMACR主要表达于细胞质中,干扰前列腺癌细胞中circAMACR的表达后,细胞的增殖和迁移能力减弱。结论:(1)通过高通量转录组测序获取的前列腺癌相关细胞系及组织中的circRNAs表达谱是可靠的。(2)circFUT8在前列腺癌相关细胞系中具有独特的差异表达模式,可能参与了前列腺癌细胞转移及雄激素非依赖转化的生物学过程。(3)circAMACR在前列腺癌中具有肿瘤特异性并且在其进展过程中具有一定的肿瘤生物学作用。第三部分环状RNA应用于前列腺癌血浆检测的初步研究目的:(1)提高前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的稳定性;(2)筛选前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目及最适内参基因组合。(3)初步探讨circRNAs应用于前列腺癌血浆检测的临床意义。方法:(1)改进血浆样本总RNA提取方法,优化前列腺癌患者血浆中circRNAs检测的qRT-PCR反应条件。(2)利用前列腺癌和良性前列腺增生各10例患者的血浆样本,对β-Actin、GAPDH、18s rRNA、β_2M、GUSB、HPRT1、PPIA、SDHA等8个候选内参基因进行qRT-PCR检测,并使用NormFinder和geNorm软件分析实验数据。(3)利用45例前列腺癌和30例良性前列腺增生患者的血浆样本,对组织测序结果中差异表达显著的29个circRNAs(表达上调9个,表达下调20个)进行qRT-PCR检测,并结合组织测序及验证结果进行分析。结果:(1)本研究实验体系下前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中qRT-PCR检测的最适内参基因数目为2个,最适内参基因组合为GAPDH和PPIA。(2)血浆qRT-PCR检测时,有9个circRNAs无扩增曲线,14个circRNAs的扩增产物电泳时无目的条带,3个circRNAs的扩增产物电泳时杂带明显,只有3个circRNAs(circAPLF、circLPAR1和circSLC45A4)在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中稳定表达。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中的总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,而circLPAR1在前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆中的总体表达水平无显著差异。结论:(1)在前列腺癌患者血浆中进行circRNAs检测是可行的,但应根据具体实验体系做出适当优化。(2)GAPDH和PPIA的内参基因组合可作为均一化标准用于前列腺癌与良性前列腺增生患者血浆样本的qRT-PCR检测。(3)circAPLF和circSLC45A4在前列腺癌患者血浆中稳定存在,且总体表达水平显著低于良性前列腺增生患者,提示其对于前列腺癌具有一定的诊断应用价值。
【图文】：

种细胞,细胞系,情况,中共

S2 275 7.56 41.7 20 151.2S3 278 4.73 25.8 20 94.6S4 273 5.05 28.0 20 101.0S5 274 7.01 38.8 20 140.2S6 277 7.05 38.5 20 141.0S7 275 5.61 30.9 20 112.2S8 274 7.70 42.6 20 154.0S9 275 7.76 42.7 20 155.2簇产生前，调整文库到 10 nM。前列腺癌相关细胞系中 circRNAs 的总体表达谱本次细胞系测序结果显示，在 RWPE-1 细胞系中共识别出 5,341 个 circRNAsV1 细胞系中共识别出 3,247 个 circRNAs，在 PC-3 细胞系中共识别出 4,30cRNAs，其中绝大部分 circRNAs 来源于蛋白质编码基因的外显子环化，cRNAs 的具体来源分类情况见图 1-2 及表 1-3。

差异表达,种细胞,细胞系,数目

C-3 2261 440 364 205 48 226 33 728 进一步比对分析后发现，有 845 个 circRNAs 在 3 种细胞系中均有表达，有circRNAs 同时在 RWPE-1 细胞系和 22RV1 细胞系中有表达，有 245 个 circR在 22RV1 细胞系和 PC-3 细胞系中有表达，有 902 个 circRNAs 同时在 RW系和 PC-3 细胞系中有表达。故本次细胞系测序共识别出 9,545 个 circRNAs前列腺癌相关细胞系中 circRNAs 的差异表达谱利用标准化的 reads 数，计算两个或两组样品间的差异表达 circRNAs。计算（fold change）和 P 值，以倍数变化≥2.0，P 值＜0.05 作为差异表达 circR值。通过比对 3 种细胞系中 circRNAs 的表达谱后发现，在 22RV1 细胞PE-1 细胞系之间共识别出 443 个差异表达 circRNAs，在 PC-3 细胞系与 22RV之间共识别出 409 个差异表达 circRNAs，在 PC-3 细胞系与 RWPE-1 细胞系别出 362 个差异表达 circRNAs（图 1-3）。3 种细胞系之间差异表达（上调、下5 的 circRNAs 见表 1-4。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25

【参考文献】