微液滴生物传感器在单细胞水平研究肿瘤细胞代谢的应用

发布时间：2020-05-16 11:10

【摘要】：癌症对人类健康的威胁日益突出,已经成为当今社会的头号致命疾病。大部分恶性肿瘤早期无明显症状,等患者出现特异性症状时,肿瘤往往已经属于晚期。国际抗癌联盟认为,1/3的癌症是可以预防的,1/3的癌症如果能早期诊断是可以治愈的。因此,发展针对恶性肿瘤的早期诊断新技术具有迫切的应用需求,并引起了科研工作者的极大兴趣。由于仪器设备的局限性及分析检测手段的灵敏度不够,传统的单细胞分析方法往往是通过大量群体细胞计算出来的平均值,容易忽略细胞间的差异性,很难在单细胞层面揭露细胞的异质性。越来越多的研究表明,分析单细胞异质性的新方法对肿瘤生物学研究和靶向治疗的发展有重要意义。本论文中,我发展了一种高通量方式产生微液滴的微流控方法。这些微液滴具有体积超小、样品消耗量少和灵敏性高等特点,它可使单个细胞处在一个封闭的微反应器中,避免了细胞之间的交叉污染,为在单细胞层面探究细胞异质性提供了一个重要的平台。本论文的研究内容和基本框架包括如下:第一部分:简要介绍了微流控技术的特点、微流控芯片的常见制备方法以及微流控芯片的典型应用。该部分还着重介绍了微流控技术的一个重要分支-微流控制备液滴,包括微液滴的生成方法及其原理、如何在微通道中操控微液滴以及微液滴的应用等。结合本论文的应用方向,该工作选取了活性氧(Reactive oxygen species(ROS))和乳酸(Lactic acid(LA))作为细胞代谢物代表,介绍了其在细胞代谢中的重要意义。第二部分:发展了玻璃毛细管微流控装置高通量地生成微液滴。利用生物矿化作用将辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase(HRP))与金团簇(Au nanoclusters(AuNCs))结合,制备了HRP-AuNCs并封装在微液滴内。它可与过氧化氢(H_2O_2)发生反应,从而导致HRP-AuNCs的荧光猝灭。控制细胞悬液浓度和分散相与连续相的流速比,可以最大概率的在每个液滴中包封1-2个细胞。通过液滴荧光变化,可以高灵敏地检测单个细胞分泌的H_2O_2含量。该实验方法具有很高的灵敏性和特异性。在此基础上,我们在单细胞水平上定量分析比较了肿瘤细胞和正常组织细胞在分泌H_2O_2方面的差异。第三部分:由于“Warburg效应”,肿瘤组织通常处在微酸性环境中,这与肿瘤细胞倾向于产生分泌乳酸有关。本论文设计了一个在微液滴内利用乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase(LDH))的作用,可发生针对乳酸的分子反应:乳酸+氧化性辅酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide(NAD~+))?丙酮酸(Pyruvic acid(PA))+还原性辅酶I(reduced nicotinamide adenine dinucleotide(NADH))+H~+。由于NADH在激光照射下可发出特征蓝色荧光,从而可以在微液滴中灵敏检测单个细胞分泌的乳酸分子含量。本论文还成功合成了海藻酸钙微凝胶,并尝试了将两种酶NAD~+和LDH固定在微凝胶内部,从而实现单个恶性肿瘤细胞分泌乳酸的灵敏检测。对本论文工作的简要总结,我们利用微液滴技术从细胞代谢方面探究了单个肿瘤细胞与正常组织细胞的差异性,并定量检测其分泌H_2O_2和乳酸分子的含量,这方面的进一步研究有可能为肿瘤疾病的早期诊断和预防提供新的工具和平台。
【图文】：

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微液滴生物传感器在单细胞水平研究肿瘤细胞代谢的应用第一章进行更精确的温度控制[25]。（4）低成本和高度集成化。由于微小液体体积的操控以及许多不同功能单元的高度集成，微流控芯片变得极其微小和紧凑（其尺寸可达到毫米大小），这也使得大量平行化实验和高通量分析成为可能。例如，通过使用微流控筛选技术，，超过一千万的适配体序列被快速检测出来并使得序列库得到极大丰富[35]。跟传统的大型检测仪器相比，微流控芯片制作成本低、携带方便并且可方便地在检测现场实时检测。当一次性芯片大批量生产时，其制造成本根据芯片大小甚至可低至1-3 美分不等[36]。（5）高度灵敏性。微流控装置有着较小的长度和宽度范围，因此，其中的流体有着较大的比表面积。微流控结构中巨大的比表面积可用来加快质量和热量的转移速率。此外，通过增加与样品的接触面积，可极大地增强敏感元件的灵敏度。

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5描绘了在 PDMS 材料中制造封闭的微通道的片的应用数的应用荧光激活细胞分选是一种常用的强大分析技，微颗粒）的总体数量可被检测出来。它的诊断、细菌分析以及临床血液学诊断。通常对细胞进行标记，用于细胞特征和属性的相学特征的新技术已经被用于细胞的筛选和研稳定性较好的半导体聚合物点，它在紫外光状态的可逆转换，从而用于某些贴壁细胞的筛
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TP212.3;R73-3

【参考文献】