去泛素化酶USP9X通过稳定Hippo通路关键激酶LATS2蛋白水平发挥抑癌功能

发布时间：2020-05-18 21:04

【摘要】：Hippo信号通路是首先在果蝇中通过遗传学筛选发现的调控细胞增殖、凋亡、器官大小以及干细胞自我更新的重要信号通路。该通路在进化上非常保守,哺乳动物中,Hippo信号通路的核心是一条激酶链,MST1/2激酶和其适配蛋白SAV共同磷酸化激活LATS1/2,活化的LATS1/2激酶和其适配蛋白MOB进一步磷酸化并抑制下游底物YAP。YAP作为Hippo信号通路的下游效应分子,是一个转录辅激活因子,它主要通过结合转录因子TEAD促进下游基因的表达。这些基因在细胞增殖、凋亡以及干细胞更新中发挥重要作用,并介导Hippo信号通路的生物学功能。胞外信号可以调控LATS1/2的磷酸化水平,进而调控其激酶活性。同时泛素化修饰也是LATS2的重要调控机制,例如细胞缺氧时,LATS2被E3泛素连接酶SIAH2泛素化修饰,进而被蛋白酶体降解。然而,目前为止我们仍不清楚调控LATS2蛋白去泛素化过程的具体机制。为了研究LATS2新的调控机制,我们从LATS2的相互作用蛋白入手,将LATS2进行蛋白串联亲和纯化。对其产物进行质谱分析发现 E3 泛素连接酶 anaphase-promoting complex/cyclosome(APC/C)复合物以及去泛素化酶USP9X是LATS2的相互作用蛋白。研究中我们观察到,细胞内的APC1和LATS2在类似膜泡结构上有共定位,但是这两个蛋白的亚细胞定位互不影响。进一步的研究证明APC/C复合物不调控LATS2的蛋白水平以及激酶活性。另一方面,细胞内敲减USP9X之后,LATS2的蛋白水平明显降低。我们进一步构建USP9X的敲除细胞,发现在敲除USP9X的细胞中LATS2的蛋白稳定性显著下降。之后通过细胞内泛素化水平检测实验以及体外去泛素化实验,我们证明去泛素化酶USP9X可以去泛素化LATS2进而保护其不被蛋白酶体降解。已有研究表明USP9X在胰腺癌中是一个抑癌基因,例如在KrasG12D诱导胰腺癌的小鼠模型中进行基因筛选,发现USP9X在多于50%的肿瘤样本中都有突变。但USP9X如何发挥抑癌功能尚不清楚。因而,我们在胰腺癌细胞中敲减USP9X,发现YAP磷酸化下降,活性上升。最后,软琼脂克隆实验以及裸鼠成瘤实验证实USP9X在胰腺癌中通过抑制LATS2以及激活YAP发挥抑癌作用。综上所述,我们的研究发现USP9X是Hippo信号通路中关键激酶LATS2的去泛素化酶。并且在胰腺癌中,USP9X通过Hippo信号通路发挥抑癌的生物学功能。本研究发现了泛素化修饰调控Hippo通路的重要机制,并阐明了 USP9X在胰腺癌中发挥抑癌作用的效应机制,为疾病治疗以及药物研发提供了新的研究方向。
【图文】：

３．１ＡＰＣ／Ｃ亚ＵＳＰ９ＸＬＡＴＳ２互３．１．１串联亲和纯化发现ＬＡＴＳ２的相互作用蛋白逡逑为了进一步阐明激酶ＬＡＴＳ２的调控机理和生物学功能，我们构建了稳定表达逡逑Ｆｌａｇ－ＳＢＰ－ＬＡＴＳ２的ＭＣＦ１０Ａ细胞。并对ＬＡＴＳ２蛋白进行串联亲和纯化，产物进逡逑行质谱分析。由此，我们希望通过发现ＬＡＴＳ２的相互作用蛋白来进一步探究其调逡逑控机制和功能。由于ＬＡＴＳ２会抑制细胞生长，构建ＬＡＴＳ２的稳定细胞会非常困逡逑难，所以我们构建了邋ＬＡＴＳ２－ＫＲ这一失活型突变体的稳定细胞用于研究。此次纯逡逑化得到很多能与ＬＡＴＳ２相互作用的蛋白（图３－１Ａ），其中Ｍ０Ｂ１Ａ和ＮＦ２是ＬＡＴＳ２逡逑已知的结合蛋白（图３－１Ｂ）。根据质谱数据中各蛋白的相互作用肽链数目的高低进逡逑行排序，在高结合能力的蛋白中包括很多与泛素化相关的蛋白，，例如去泛素化酶逡逑ＵＳＰ９Ｘ以及Ｅ３泛素连接酶ＡＰＣ／Ｃ复合物中的很多亚基（ＡＮＡＰＣ１、ＡＮＡＰＣ５、逡逑ＣＤＣ１６、ＣＤＣ２３和ＣＤＣ２６）（图３－１Ｂ）。同时，我们通过免疫印迹的方法证实ＬＡＴＳ２逡逑的邋ＴＡＰ邋样品中邋ＡＰＣ１邋（ＡＮＡＰＣ１）、ＡＰＣ５邋（ＡＮＡＰＣ５）以及邋ＵＳＰ９Ｘ邋确实和邋ＬＡＴＳ２逡逑存在相互作用（图３－１Ｃ）。逡逑

细胞中转染相应的质粒，ＵＳＰ９Ｘ－ＣＡ是ＵＳＰ９Ｘ的Ｃ１５６６Ａ失活突变体。细胞裂解逡逑液使用抗ＨＡ的抗体进行免疫沉淀，样品通过免疫印迹的方法检测。Ｂ，内源ＵＳＰ９Ｘ逡逑和ＬＡＴＳ２存在相互作用。ＭＣＦ１０Ａ细胞中内源的ＵＳＰ９Ｘ和ＬＡＴＳ２分别用抗ＵＳＰ９Ｘ逡逑和ＬＡＴＳ２的抗体进行免疫沉淀。Ｃ，邋ＬＡＴＳ２结合ＵＳＰ９Ｘ的能力比ＡＭＯＴ强。逡逑ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中转染相应的质粒，细胞裂解液使用抗Ｈａｇ的抗体进行免疫沉淀。逡逑Ｄ，邋ＬＡＴＳ２和ＡＭＯＴＬ２结合ＵＳＰ９Ｘ的能力互不影响。实验方法参照图Ｃ。逡逑３．２ＡＰＣ１和ＵＳＰ９Ｘ分别与ＬＡＴＳ２的不同区域存在相互作用逡逑３．２．１邋ＡＰＣ１的１６４９－１７４８片段和ＬＡＴＳ２的Ｎ端１－９０区域存在相互作用逡逑为了明确ＡＰＣ１和ＬＡＴＳ２的具体结合区域，我们构建一系列ＡＰＣ１以及ＬＡＴＳ２逡逑的截短体和突变体。由于在构建ＡＰＣ１野生型质粒时意外得到并发现ＡＰＣ１的１－逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R73-3

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本文编号：2670306