【摘要】：目的乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。随着对乳腺癌认识的不断深入,以雌激素受体(estrogen receptor,ER),孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)为代表的重要生物标记物被发现。这些生物标记物帮助临床医生对乳腺癌患者的预后做出更准确的判断,此外一些以此为靶点的治疗手段(例如内分泌治疗和抗HRE2靶向治疗)也逐渐问世,有效的延长了乳腺癌患者的生存时间。但仍然有部分患者无法从现存的靶向治疗中获益,而且随着耐药性的产生,亟需寻找更为有效的乳腺癌治疗靶点。作为人体内蛋白质主要的降解途径,蛋白酶体途径异常可以通过增强癌蛋白稳定性或者促进抑癌蛋白的降解参与肿瘤的发生发展。探索泛素-蛋白酶体途径,寻找新肿瘤治疗靶点正逐渐成为热点。组成型光形态建成蛋白9(constitutive photomorphogenesis 9,COP9)信号复合体(CSN)六号亚单位(CSN6)可以作为一个泛素化修饰的调节因子参与细胞周期调控,DNA损伤修复等生物过程。E3泛素连接酶决定了蛋白酶体途径降解底物蛋白的特异性。机制研究发现CSN6可以广泛作用于各种类型的E3泛素连接酶,通过调节其活性影响肿瘤相关蛋白质的泛素修饰及降解,参与肿瘤的发生发展。CSN6在乳腺癌中发挥的作用还缺乏直接而系统的证据。本研究探讨CSN6与乳腺癌患者预后的相关性,探讨CSN6对乳腺癌细胞生长,迁移及侵袭的影响,并构建CSN6在乳腺癌中信号调节网络,为明确乳腺癌发生发展的分子机制提供依据。材料与方法一、验证CSN6在乳腺癌中的表达1、免疫组织化学染色法验证本院手术乳腺癌患者标本CSN6蛋白水平表达;2、Oncomine和Kaplan-Meier plotter公共数据平台验证数据库中包含的乳腺癌患者CSN6 m RNA水平表达。二、CSN6表达与临床病理学特征和预后的关系1、采用SPSS 18.0统计分析软件卡方检验分析CSN6蛋白与乳腺癌患者临床病理学特征之间的关系,Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型进行生存分析;2、Oncomine公共数据平台验证CSN6 m RNA与乳腺癌患者临床病理学特征的关系;3、Kaplan-Meier plotter公共数据平台验证CSN6 m RNA与乳腺癌患者预后的关系。三、使用慢病毒载体构建稳定敲减CSN6基因的乳腺癌细胞系MCF7,T47D和MDA-MB-2311、采用倒置荧光显微镜观察细胞形态及慢病毒转染效率;2、Western blot确定敲减效率。四、验证CSN6对乳腺癌细胞生长和侵袭转移的影响1、MTS实验观察CSN6对乳腺癌细胞MCF7,T47D和MDA-MB-231活力的影响;2、克隆形成实验观察CSN6对乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231增殖的影响;3、Transwell实验检测CSN6对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭和转移的影响。五、乳腺癌中CSN6信号调节网络的生物信息学分析1、乳腺癌GEO数据集GSE25066的下载,数据处理及差异表达基因分析;2、使用GO分析和KEGG分析寻找CSN6相关差异表达基因富集的生物学过程和信号通路;3、皮尔森相关系数计算CSN6与其他基因的相关性,筛选出共表达基因集,绘制共表达基因与CSN6的关系图。使用String数据库对共表达基因集进行分析,制作CSN6相关的共表达互作网络。结果1、CSN6与乳腺癌高危临床病理学特征相关。CSN6蛋白的高表达与肿物大小(P=0.041),淋巴结转移(P=0.01)和肿瘤的TNM分期(P=0.002)呈现正相关关系。乳腺癌转移灶中CSN6 m RNA的表达显著高于原发灶(差异倍数值=2.154,差异显著性P值=0.022)。在分子亚型方面,HER2阳性型乳腺癌有CSN6蛋白高表达的趋势(85.7%),虽然结果不具备统计学意义(P=0.052)。2、CSN6与乳腺癌患者的不良预后相关。CSN6 m RNA的高表达与乳腺癌患者无复发生存时间(风险比=1.19,95%可信区间:1.07-1.33,log-rank P值=0.0015),无远处转移生存时间(风险比=1.26,95%可信区间:1.02-1.54,log-rank P值=0.028)呈负相关。CSN6蛋白高表达与乳腺癌患者无病生存时间(log-rank P值=0.028)和总生存时间(log-rank P值=0.038)呈负相关,而且是影响无病生存时间的独立预后因素(风险比=3.83,95%可信区间:1.14-12.79,P值=0.029)。进一步探索CSN6对不同分子亚型乳腺癌预后的影响,CSN6 m RNA高表达在四种分子分型的乳腺癌患者中都与无复发生存时间呈负相关,但在Luminal B型(风险比=1.53,95%可信区间:1.25-1.88,log-rank P值=2.9e-05)和Basal like型(风险比=1.48,95%可信区间:1.15-1.91,log-rank P值=0.0023)的乳腺癌患者中更为明显,具有统计学差异。3、敲减CSN6抑制乳腺癌细胞的活力和增殖。MTS实验检测敲减CSN6前后不同时间点乳腺癌细胞MCF7,T47D和MDA-MB-231活力。结果显示,培养120小时后,MCF7/KD的细胞增殖率为209.22±9.76%,MCF7/NC-KD细胞增殖率为306.85±35.36%(P=0.014)。T47D/KD细胞增殖率为284.43±1.65%%,T47D/NC-KD细胞增殖率为356.59±14.22%(P=0.012)。MDA-MB-231/KD细胞增殖率为310.30±11.76%,MDA-MB-231/NC-KD细胞增殖率为348.52±19.25%(P=0.043)。克隆形成实验显示,培养14天后,MCF7/KD的细胞集落数量为66.67±13.65个,MCF7/NC-KD细胞集落数量为115±15.72(P=0.016);MDA-MB-231/KD的细胞集落数量为141±40.04,MDA-MB-231/NC-KD细胞集落数量为374.67±28.31(P=0.001)。4、敲减CSN6抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。通过Transwell迁移实验发现,孵育24小时后,未铺基质胶的Transwell实验组MDA-MB-231/KD的细胞迁移数量为26.89±4.33,MDA-MB-231/NC-KD的细胞迁移数量为49.44±6.30(P=0.007);铺基质胶的Transwell实验组MDA-MB-231/KD的细胞迁移数量为16.89±8.76,MDA-MB-231/NC-KD的细胞迁移数量为41.22±7.41(P=0.021)。5、乳腺癌中CSN6可能参与肿瘤免疫应答和细胞粘附的过程。GO分析生物过程富集结果中,与免疫应答(immune response,positive regulation of immune system process)和细胞粘附(cell adhesion,extracellular structure organization)描述相关的生物过程多次出现。在KEGG通路富集分析中可以观察到与此类似的现象(Th1 and Th2 cell differentiation;Cell adhesion molecules,ECM-receptor interaction,Focal adhesion)。6、乳腺癌CSN6共表达基因的网络关系及蛋白调控互作关系网络的建立。我们发现CSN6基因与ILF2基因的共表达基因集有较高的重合率,而且二者的在多个Oncomine数据集中都存在正相关趋势。结论1、CSN6高表达与乳腺癌肿瘤大小,淋巴结转移和远处转移相关。2、CSN6高表达与乳腺癌患者不良生存相关,而且CSN6蛋白高表达可以作为乳腺癌患者无病生存时间的独立不良预后因素。3、CSN6 m RNA高表达对Luminal B型和Basal like型乳腺癌患者生存的影响更为明显。4、敲减CSN6抑制乳腺癌细胞MCF7,T47D和MDA-MB-231的增殖活力。5、敲减CSN6抑制乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231克隆形成能力。6、敲减CSN6抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭和迁移。7、CSN6相关差异表达基因富集在细胞粘附过程中,提示CSN6在乳腺癌侵袭转移过程中发挥比较显著的促进作用。8、CSN6相关差异表达基因富集在免疫调节激活过程中,提示CSN6可能参与乳腺癌肿瘤免疫应答。9、某些肿瘤相关基因E2F1,HRAS,Caspase 9,WBSCR22作为节点,在乳腺癌CSN6共表达网络中发挥比较重要的调控作用。10、ILF2可能参与了CSN6促进乳腺癌发展的过程。
【图文】：
中国医科大学博士学位论文3 实验结果3.1 CSN6 与乳腺癌临床病理学特征的关系3.1.1 CSN6 mRNA 表达与临床病理学特征的关系在Oncomine公共数据平台中输入筛选标准（P-VALUE<0.05，FOLDCHANGE>1.5，，GENE RANK TOP 10%）之后，CSN6在各个肿瘤中的表达状态如图1所示。
图2 Oncomine公共数据平台分析CSN6在乳腺癌组织中的表达A. CSN6表达与N分期的关系（Weigelt乳腺数据集），B. CSN6表达与M分期的关系（Bittner乳腺数据集），C. CSN6在原发灶与转移灶的表达情况（Weigelt乳腺数据集）3.1.2 CSN6 蛋白表达与临床病理学特征的关系搜集到本院214例乳腺癌患者基本临床信息如表1所示。入组患者年龄25~88岁，中位年龄51岁。表1 免疫组化染色纳入患者的基本信息Number % Number %Age(year)mean(SD) 51.67 (10.74) ER statusmedian(range) 51 (25-88) Negative 72 33.6<50 101 47.2 Positive 132 61.7
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
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