RGD靶向载DOX声学造影剂空化增敏肝癌化疗的实验研究

发布时间：2020-05-31 06:42

【摘要】：目的:肝癌是一种恶性程度较高的消化系统肿瘤,其治疗方式以手术为核心,但因其发病隐匿,只有少数患者就诊时可以获得手术机会。化疗为晚期肝癌治疗方式之一,但大部分患者无法承受化疗药物全身毒副作用,故限制了其临床应用。近年来研究发现超声造影剂可作为载体实现药物靶向递送,从而减少药物毒副作用。因此,本文研究制备RGD靶向载阿霉素纳米泡减少化疗副作用,增敏晚期肝癌的化疗效果。方法:(1)采用薄膜水合法制备空白磷脂纳米泡(DP)、RGD磷脂纳米泡(RDP)及RGD载DOX磷脂纳米泡(RDPD),通过透射电子显微镜及光学显微镜观察其形态,粒径检测仪检测其粒径大小、粒径分布情况及表面电位情况,利用酶标仪测量RDPD载药量及包封率,评价其载药能力。(2)检测DP纳米泡、RDP纳米泡及RDPD纳米泡体外显影效果。应用细胞计数原理检测以上纳米泡体外稳定性,并绘制体外稳定性曲线。(3)利用超声诊断仪检测其体内稳定性及测定TIC曲线,评估三种造影剂达峰强度、达峰时间及曲线下面积(AUC),并比较三种纳米泡以上指标差异。(4)利用细胞培养技术,检测DP、RDP、RDPD纳米泡体内急性毒性及细胞毒性,评价以上三种纳米泡生物安全性。(5)建立裸鼠肝癌皮下瘤模型,利用超声诊断仪评价DP、RDP及RDPD纳米泡肿瘤靶向性。采用免疫组织化学染色的方法检测正常裸鼠肝脏及皮下瘤αvβ3整合素阳性表达情况。(6)将成功建模荷瘤鼠分为5组,分别给予同等剂量生理盐水、空白纳米泡、RGD纳米泡、RGD携DOX纳米泡、DOX溶液,比较各组间给药前后肿瘤大小、超声弹性成像及组织病理差异。结果:(1)采用薄膜水合法成功制备空白磷脂纳米泡(DP)、RGD磷脂纳米泡(RDP)及RGD携DOX磷脂纳米泡(RDPD),其粒径分别为292 nm、303 nm、322 nm,其电位分别为-3.69 mv、-2.69 mv、-2.68 mv。RDPD载药量为3.02%,包封率为71%,载药能力良好。(2)DP、RDP、RDPD纳米泡均可实现体外显影,且显影效果良好。初始纳米泡浓度三组间无明显差异(P0.05)。(3)评估DP、RDP、RDPD三种造影剂达峰强度、达峰时间及AUC曲线下面积均无明显差异(P=0.176、0.100、0.7330.05)。体内稳定性DP与RDP、RDPD差异有统计学意义(P=0.046、0.0380.05)。(4)DP与RDP不具有细胞毒性,而DOX溶液与RDPD具有细胞毒性。DOX溶液组与RDPD组细胞毒性差异有统计学意义(P0.001)。DP与RDP无明显体内毒性,DOX溶液与RDPD均有体内毒性。RDPD组体内毒性与DOX差异有统计学意义(P=0.04930.05)。病理表现可见DOX组具有心脏毒性,其余各组病理表现均正常。(5)RDP及RDPD组空化前后db值差异有统计学意义(P=0.007、0.0040.05),RDP、RDPD组空化前后db值差值与DP组差异有统计学意义(P=0.032、0.0080.05)。免疫组化结果表明肿瘤组织αvβ3表达阳性,而肝脏组织表达极低。(6)RDPD组与DOX组肿瘤体积变化较空白组差异有统计学意义(P0.001),RDPD组较DOX组肿瘤体积变化差异有统计学意义(P=0.0080.05)。RDPD组与DOX组瘤体硬度较空白组差异有统计学意义(P=0.001、0.0020.05),RDPD组较DOX组瘤体硬度差异有统计学意义(P=0.0110.05)。各组瘤体病理结果显示:RDPD组肿瘤坏死最为明显,DOX组可见部分坏死,RDP组可见极少坏死,DP组与空白对照组未见明显坏死区域。结论:1、采用薄膜水合法可制备空白磷脂纳米泡、RGD靶向纳米泡及RGD携载DOX纳米泡,其粒径分布均匀,体内外稳定性、成像效果均较好,载药量与包封率尚佳。空白纳米泡及RGD纳米泡不具有体内毒性及细胞毒性,但RGD载DOX纳米泡具有细胞毒性。相比于DOX溶液,RDPD体内毒性较低,可实现化疗药物体内减毒。2、肝癌新生血管avβ3受体表达程度较高,而正常肝脏组织avβ3受体表达极低。携RGD肽纳米泡载体具有肝癌靶向性,可靶向肝癌新生血管,结合UTMD技术,可实现化疗药物靶向释放,从而提高肿瘤局部血药浓度。起到增敏晚期肝癌化疗效果的作用。但本实验未对其机制进行研究,故后期仍需进一步探索。
【图文】：

流程图,免疫组化,流程图,尾静脉

图 2-1 免疫组化流程图2.13 裸鼠肝癌皮下瘤载药纳米泡与全身化疗治疗效果对比如上述方式建立裸鼠肝癌皮下瘤模型，待瘤体大小到达预期大小后，将建模成功的荷瘤裸鼠 35 只随机分为 5 组，分别为空白对照组、DP 组、RDP 组、RDPD 组及 DOX 溶液组，每组给予干预如下：所有裸鼠均在相对无菌环境中进行操作，称重后利用 4 %水合氯醛腹腔注射麻醉。酒精棉球擦拭尾部，待尾静脉充分扩张后置管。利用超声诊断仪测量皮下瘤径线；弹性成像测量瘤体硬度，，并留图。1）空白对照组：经尾静脉给予 0.05 ml 无菌生理盐水，每三天干预一次，共干预 4 次。2）DP 组：以 60 mg/kg 冻干粉剂量配制 DP 混悬液，经尾静脉给予 0.05 ml。通过超声诊断仪观察瘤体造影情况后，调至 flash 模式开启空化功能（MI=1.0)。

粒径分布,冻干粉,纳米

津医科大学硕士学位论文肝癌RGD靶向载Dox声学造影剂空化增敏化疗的实验研究结果.1 空白 DP、RDP 及 RDPD 纳米泡的制备及表征.1.1 镜下形态、粒径分布及电位采用薄膜水合法成功制备出空白纳米泡（DP）、RGD 靶向纳米泡（RDP） RGD 载 DOX 靶向纳米泡（RDPD）,其冻干粉分别为白色、白色及粉色粉末，地均匀，无较大颗粒状物质如图 3-1。冻干粉可保存较长时间，其水溶性佳，用 10 %甘油 PBS 液溶解，振荡即可得相应纳米泡溶液如图 3-2。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】