ECT2参与DNA损伤修复的分子机理探索

发布时间：2020-06-01 06:33

【摘要】：目的:基因组的稳定性对生命体的生长、发育、代谢、疾病有着重要意义。近些年,越来越多的癌症被发现与基因组不稳定有直接关系。这主要是因为细胞发生DNA损伤时,细胞内的修复机制发生异常,基因组变的不稳定,促进了肿瘤的发生发展。在临床诊疗和研究过程中,研究人员还发现部分肿瘤细胞可以通过DNA损伤修复对放化疗产生耐受性,导致患者生存率降低和不良预后。所以,DNA损伤修复机制的研究已成为近年来肿瘤的发病机制、药物研发和治疗等领域的一个研究热点。在长期的研究过程中,人们发现模块化的BRCA1羧基末端(BRCT)结构域经常出现在DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)涉及的蛋白质中,比如MDC1,TP53BP1,PARP1,BARD1等,它可以作为单个或串联结构域(tBRCT)存在结合被磷酸化的多肽。ECT2(epithelial cell transforming 2)是一种含BRCT的蛋白质,也是一种小GTPases的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF),之前研究最多的是其在细胞分裂中的功能。ECT2是否能够参与DNA损伤修复有待于更深入的研究。方法:通过染色质组分分离以及激光切割,免疫荧光染色等实验探究ECT2能否募集到DNA双链损伤位点。药物处理并用波长365 nm激光切割稳定表达GFP-ECT2的细胞,检测ECT2的募集受什么途径影响。接着,我们用HR-DRGFP和NHEJ-GFP系统研究ECT2对HR和NHEJ两种修复途径修复效率的影响,进行挽救实验验证实验结果。然后,我们再利用免疫荧光和波长365 nm激光切割细胞检测敲低ECT2对BRCA1 foci和KU70募集的影响,侧面验证HR-DRGFP和NHEJ-GFP的结果。利用免疫亲和纯化、银染和质谱分析鉴定出ECT2的相互作用蛋白。最后通过平板克隆形成以及MTS实验,检测DNA损伤下细胞的增殖及存活。结果:1、ECT2能够募集到DNA双链损伤位点。2、ECT2在DNA双链损伤位点的募集是依赖于PARP1的。3、敲低ECT2能同时降低HR和NHEJ的修复效率,并且抑制了DNA损伤位点处BRCA1和KU70的募集。4、ECT2与PARP1,BLM,KU70,KU80,RAD50,BRCA1等HR和NHEJ两种修复途径的关键蛋白都存在相互作用。5、ECT2使细胞对基因毒性的耐受性增强。结论:ECT2是依赖于PARP1募集到DNA双链断裂损伤位点的。且ECT2能够影响BRCA1和KU70的招募,最终从HR和NHEJ两种途径参与DNA损伤修复。ECT2还能够促进宫颈肿瘤细胞在DNA损伤条件下的存活和增殖,综上所述,我们发现ECT2在DNA损伤应答和修复中的起到非常重要的作用,从而维持基因组的稳定,提示我们ECT2可能作为肿瘤治疗的一个潜在靶点。
【图文】：

区域图,染色质,DNA损伤,位点

10）DAPI 染核封片，将八小孔培养皿撬开只留底部的玻璃片，将 DAPI 滴在小孔上，用盖玻片轻轻抹匀后盖上，注意不能产生气泡。玻璃趴片只需在载玻片上滴好 DAPI，再将趴片倒盖在 DAPI 上即可。封好的片子，4 ℃避光保存；11）用激光扫描共聚焦显微镜拍照，整理结果。1.2 结果1.2.1 ECT2 能够在 DNA 损伤时富集到染色质上为了探究 ECT2 在 DDR 中的作用，我们使用了 ER-AsiSI 系统，该系统的优势是在 4-羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, 4-OHT）的处理下，能够引发限制性核酸内切酶 AsiSI 被诱导转移入核，从而导致 DSBs，再通过 Western-blotting检测了发生 DSB 的标志蛋白 H2AX，发现该系统在加 4-OHT 处理后， H2AX 的蛋白表达水平明显升高（图 1A），表明系统的高效可行。随后通过不同时长的4-OHT 处理细胞后进行细胞组分分离染色质蛋白，我们发现，当 AsiSI 造成 DSBs后，ECT2 在染色质上发生了富集（图 1B）。

DNA损伤,位点

津医科大学硕士学位论文一、ECT2 能够募集到 DNA 双链断裂损用时间梯度的 4-OHT 处理，收集细胞进行细胞组分分离，将染色质蛋estern-blotting 检测染色质上 ECT2 的蛋白水平。.2.2 ECT2 能够募集到 DNA 损伤位点为了充分验证上述结论的可靠性，我们又利用蔡司 PALM MicroBe光显微切割系统对 HeLa 细胞进行了激光切割，切割后立即固定细胞，荧光实验，染 ECT2 和 H2AX，发现被激光划过的细胞中间出现一条CT2 的富集形成的亮线，且 ECT2 和 H2AX 有共定位（图 2），说明当损伤时，ECT2 迅速的在损伤位点发生了富集，并且在持续近半个小时没有出现变弱的迹象，至于为何蛋白会富集如此长时间，还有待于进。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.2

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