基于生信分析KIF4A在乳腺癌中的预后预测作用及上游miR-335对其调控的研究

发布时间：2020-06-04 12:49

【摘要】：目的:尽管近年来筛查和诊疗技术的进步,在很大程度上提高了乳腺癌患者的生存率,其仍是女性死亡率最高的的重大疾病之一,其治疗结果存在巨大的个体差异。目前的遗传预后预测方案大都基于基因芯片,在缺乏特异性的同时,可能给患者带来额外的经济负担。因此,发掘更为精准和经济的新型生物标志物进行预后预测具有重要的临床意义。人类驱动蛋白家族成员4A(kinesin family member 4A,KIF4A)在多种细胞生理活动进程中发挥关键作用,如染色体浓聚,细胞有丝分裂等。近年来,不断有证据证实KIF4A在胃癌、肺癌、宫颈癌、肝癌,乳腺癌等多种肿瘤发生及进展中起到的重要作用。本研究通过对TCGA和GEO数据集进行深入生物信息学分析,以及通过体外实验验证,评估KIF4A的表达与乳腺癌的临床特征和预后预测之间的关系及其可能miRNA调控因子的作用机制,探究KIF4A作为潜在的乳腺癌生物标志物的预后预测价值。方法:第一部分研究从GEO数据库和TCGA数据库下载具有相应临床和随访信息的人乳腺组织基因表达谱数据集用于评估KIF4A的表达和乳腺癌临床特征之间的关系。基于每个数据集的mRNA表达百分位数将患者重新分层为四个亚组(Q1,Q2,Q3和Q4),小于中值的表达水平定义为低KIF4A(Q1+Q2),而大于或等于中值的表达水平定义为是高KIF4A(Q3 + Q4)。使用R语言管理基因表达谱数据库,评估KIF4A的表达与乳腺癌预后之间的关系。使用GSEA分析研究KIF4A的表达和临床特征相关性及生物学效应。第二部分研究选取10种乳腺癌细胞系,采用RT-PCR及Western-blot的方法检测KIF4A在乳癌细胞中的表达情况,选取高表达KIF4A的MDA-MB-231细胞进行下一步功能实验。构建靶向KIF4A的shRNA及相应的阴性对照序列,分别转染入乳腺癌细胞后,采用CCK-8检测细胞增殖活性,应用流式细胞技术检测细胞凋亡情况,以及克隆形成实验检测细胞集落形成能力,同时采用Westem-blot的方法检测敲低KIF4A之后细胞内凋亡相关蛋白的表达情况。第三部分研究使用TCGA数据库和GEO数据库中GSE22220数据集筛选与乳腺癌中KIF4A表达相关的miRNA,应用miRanda算法预测可能具有KIF4AmRNA结合位点的miRNA,两者取交集得到最有可能参与KIF4A表达调控的miRNA。利用双荧光素酶报告基因测定来验证miR-335与靶基因KIF4A的直接作用。结果:第一部分研究结果显示,KIF4A的mRNA表达水平与肿瘤大小和分级显著相关,和淋巴转移无显著相关。在GSE1456数据集中,基底样乳腺癌中KIF4A的表达明显更高。对GSE1456数据集进行进一步的GSEA分析表明,KIF4A高表达的表型显著富集了与肿瘤分级高有关的基因标签,提示KIF4A与乳腺癌易感性、侵袭、转移和复发密切相关。对TCGA数据集及GEO数据集进行生存分析,发现KIF4A的高表达与总生存(OS)和无进展生存(PFS)低显著相关。随着KIF4A表达的增加,OS和PFS逐渐下降,几乎呈剂量依赖性。对GEO合并数据的进一步分层分析表明,ER阳性和ER阴性亚型中KIF4A表达水平与OS和PFS不佳显著相关。这些研究结果表明,乳腺癌中KIF4A可作为乳腺癌预后的有力预测指标。第二部分研究进一步在10种乳腺癌细胞系中明确KIFA4的表达情况并通过体外细胞系实验初步探究KIFA4对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响。RT-PCR及Westem-blot均显示KIF4A在多种乳腺癌细胞系中高表达,选取MDA-MB-231细胞来进行Knock-down实验。结果发现,敲低KIF4A表达后MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖能力及集落形成能力显著低于对照组,且流式细胞分析显示敲低KIF4A mRNA表达后MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡数目较对照组明显增多。为了进一步探索KIFA4调控乳腺癌凋亡的作用机制,采用Western-blot的方法检测敲低KIF4A表达之后,细胞内凋亡相关蛋白Cleaved-PARP以及Cleaved-Caspase-3表达显著增加。第三部分研究对TCGA数据库分析显示miR-335的表达与患者生存期及淋巴结转移存在相关性。KIF4A的表达水平与miR-335和miR-411的表达呈负相关。利用miRanda算法预测可能具有KIF4A mRNA结合位点的miRNA,取两种筛选miRNA的交集,提示在乳腺癌中miR-335和miR-411可能是KIF4A对应的调控miRNA。通过进一步分层分析,提示乳腺癌PFS预后情况以表达水平依赖的方式与miR-335的表达相关,而非与miR-411的表达相关,于是选择miR-335利用双荧光素酶报告基因测定,表明miR-335通过靶向KIF4A mRNA的3'-UTR来抑制KIF4A表达。结论:第一部分研究发现KIF4A表达和乳腺癌大小和分级显著相关,在基底样乳腺癌中KIF4A的表达显著升高。GSEA分析提示KIF4A与乳腺癌易感性、侵袭、转移和复发密切相关。进一步生存分析发现KIF4A的高表达与预后不良显著相关,KIF4A可作为乳腺癌预后的潜在预测指标。第二部分通过体外实验研究KIF4A在乳腺癌细胞系中的表达情况及其功能。KIF4A在多种乳腺癌细胞系中高表达,其中在MDA-MB-231中表达最高。采用shRNA敲低KIF4A的表达,发现MDA-MB-231细胞的增殖能力明显下降,流式细胞分析显示敲低KIF4A表达之后,MDA-MB-231细胞凋亡显著增加。这提示我们KIF4A通过调控乳腺癌细胞增殖及凋亡从而影响肿瘤进展。第三部分研究根据GSE22220数据集筛选与乳腺癌中KIF4A表达相关的miRNA,KIF4A的水平与miR-335和miR-411的表达呈负相关。提示miR-335和miR-411可能是KIF4A对应的调控miRNA,联合TCGA数据库分析根据miRanda算法,最终发现了 miR-335是调控KIF4A的关键miRNA。双荧光素酶报告基因测定验证miR-335通过靶向KIF4A mRNA的3'-UTR来抑制KIF4A表达,进而影响乳腺癌PFS预后情况。
【图文】：

博士学位论文逦第一部分结果逡逑１．２）ＫＩＦ４Ａ逡逑高（％）逦低（％）逦户值＊＊逡逑＋逦１８２邋（９１．５）逦１７逦（８．５）逡逑逦２７邋（１９．３）逦１１３逦（８０．７）逡逑样逦９４邋（４７．２）逦１０５逦（５２．８）逡逑化疗逦＜０．０００１逡逑６８３邋（４５．３）逦８２５逦（５４．７）逡逑２６９邋（６７．９）逦１２７逦（３２．１）逡逑计学意义，ｍＰ＜0．0５。逡逑

％逦Ｈａ．逡逑咖ｎＯＵ逡逑图１．１邋ＫＩＦ４Ａ在乳腺癌组织中的表达情况不同临床特征的关系逡逑ＫＩＦ４ＡｍＲＮＡ的表徸水平与肿瘤大小和分级显著相关，，但与淋巴结侵袭无关逡逑＊＊邋尸邋＜０．０１逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

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本文编号：2696415