MiR-1268b通过下调PI3K-Akt通路抑制乳腺癌化疗耐药

发布时间：2020-06-05 07:29

【摘要】：背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康。化疗是治疗乳腺癌的重要手段,乳腺癌新辅助化疗已被广泛应用于临床,但多耐药的的产生又是导致化疗失败的关键因素。近年来,越来越多的实验证实miRNA与肿瘤的发生发展和化疗耐药密切相关。MiRNAs能够通过碱基互补配对的方式阻碍或降解靶mRNA从而抑制药物诱导的凋亡基因或信号传导通路基因,导致耐药。MiRNA-1268b是一种在任何肿瘤中尚未深入研究且功能机制不清楚的miRNA分子。本研究揭示了miR-1268b对乳腺癌发生发展以及化疗耐药的调节机制。方法:首先从乳腺癌耐药相关的miRNA组织芯片中选取了具有表达差异的miR-1268b。随后收集乳腺癌穿刺组织样本及同病例化疗后手术切除组织样本,并根据化疗敏感性分为敏感组和耐药组,通过查阅及电话随访完善各病例的临床资料。用试剂盒从组织标本中提取总miRNA,逆转录,实时荧光定量PCR检测每例组织样本中miR-1268b的表达量,并根据结果进行临床资料分析,从而进一步确定miR-1268b为研究对象。在乳腺癌两种细胞系中瞬时转染促进miRNA过表达和抑制其表达的miRNA mimics和inhibitor,并用CCK8和EdU实验检测miR-1268b对乳腺癌增殖能力的影响。用Transwell实验检测miR-1268b对乳腺癌细胞迁移和浸润能力的影响。用流式细胞学技术检测miR-1268b对乳腺癌细胞凋亡能力的影响。用miRWalk2.0综合十种软件预测miR-1268b的靶基因,并构建与靶基因结合位点的3'UTR质粒,用双荧光素酶实验、Western blot和细胞免疫组化进行验证。通过软件预测和通路数据库查询,确定经典经典下游通路PI3K-Akt进一步研究,实时荧光定量PCR及Western blot验证miR-1268b与该通路中的分子及凋亡相关蛋白的关系。结果:实时荧光定量PCR检测及临床病理参数分析:RT-qPCR及临床资料分析结果显示,miR-1268b在化疗敏感组织中高表达,并且与肿瘤分期有关。并且随着肿瘤分期的增加,miR-1268b的表达量降低。随后验证了 miR-1268b在乳腺癌7中细胞系中的表达,其中miR-1268b在ERBB2阳性细胞中低表达。在亲本细胞MCF-7中较耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADM的表达显著上调。同时,在低侵袭力的乳腺癌细胞中,miR-1268b的表达相比于高侵袭力的乳腺癌细胞明显增加。体外细胞功能学实验:增殖实验EdU和CCK8、迁移浸润实验证明在乳腺癌两种细胞系中上调或下调miR-1268b的表达,细胞增殖能力和迁移浸润能力均未发生明显变化。凋亡实验中,分别在乳腺癌两种细胞系中上调miR-1268b的表达量可以促进乳腺癌细胞凋亡,下调miR-1268b可以抑制乳腺癌细胞的凋亡,提示miR-1268b与乳腺癌细胞的凋亡能力呈正相关。在一定药物浓度梯度中,上调miR-1268b的表达可以抑制细胞的活力,下调可以促进细胞活力,提示miR-1268b可以抑制乳腺癌细胞的耐药性。靶基因预测和验证:用miRWalk2.0综合十种软件分别预测miR-1268b的靶基因,并通过查文献及双荧光素酶实验检测,证实miR-1268b可与ERBB2的3'-UTR区结合。Western blot和细胞免疫组化实验进一步证明,在miR-1268b过表达的细胞中相较于对照组,ERBB2和AKT2的表达量明显降低,提示ERBB2为miR-1268b的直接靶基因。通路预测和验证:通过软件预测和通路数据库查询,确定经典经典下游通路ERBB2-PI3K-AKT进一步研究,实时荧光定量PCR及western blot验证miR-1268b可以显著下调该通路中的分子ERBB2、PIK3CA、AKT,同时可以下调与凋亡相关的蛋白Bcl2。结论:MiR-1268b可以通过下调ERBB2-PI3K-Akt通路抑制乳腺癌化疗耐药,另一方面也可以通过下调Bc12的表达促进凋亡,从而抑制乳腺癌化疗耐药。
【图文】：

图１．邋ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺癌组织和细胞系中的差异表达。逡逑（Ａ）逦ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示，相比在乳腺癌耐药组中，ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺癌敏感组中表达上逡逑调邋９．６邋倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｂ）逦ｍｉＲ－１２６８ｂ在ＥＲＢＢ２低表达组中相较于ＥＲＢＢ２高表达组上调１７．５倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｃ）检测乳腺癌６种细胞系中ｍｉＲ－１２６８ｂ的表达，相比于其他细胞系，ｍｉＲ－１２６８ｂ在乳腺逡逑癌耐阿霉素细胞系ＭＣＦ－７／ＡＤＭ和ＥＲＢＢ２过表达细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－４５３中低表达。其中，逡逑ｍｉＲ－１２６８ｂ邋在邋ＭＣＦ－７邋中的表达比在邋ＭＣＦ－７／ＡＤＭ邋中的表达高邋７．９邋倍（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。逡逑（Ｄ，Ｅ）在乳腺癌两种细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ａｎｄ邋ＭＤＡ－ＭＢ－４６８中，转染ｍｉＲ－１２６８邋ｍｉｍｉｃｓ逡逑或ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｍｉＲ－１２６８ｂ的表达量分别上调３１２？１３３６３倍或者下调２逡逑

图２．邋ｍｉＲ－１２６８ｂ对乳腺癌细胞的增值能力无明显影响。逡逑（Ａ，Ｂ，Ｅ，，Ｆ）ＥＤＵ实验结果显示，在乳腺癌两种细胞系ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和ＭＤＡ－ＭＢ－４６８逡逑中，ｍｉＲ－１２６８ｂ过表达对乳腺癌细胞的增殖能力无明显作用。逡逑（Ｃ，邋Ｄ，ＱＨ）ＥＤＵ实验结果证明，ｍｉＲ－１２６８ｂ低表达，乳腺癌细胞的增殖能力无明显变化。逡逑（Ｉ，邋Ｊ，邋Ｋ，邋Ｌ）邋ＣＣＫ８实验与ＥＤＵ实验结果一致，ｍｉＲ－１２６８ｂ对乳腺癌细胞增殖能力无明显影逡逑响。逡逑３８逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9

【相似文献】

相关期刊论文 前6条

1 李翠凡;曹迎东;李晖;陈宗德;李明善;李晓芳;;联合沙格列汀治疗老年糖尿病肾病对炎症因子和单个核细胞PI3K-Akt通路的影响[J];免疫学杂志;2018年08期

2 李锋;李静静;娄淑杰;;有氧运动激活肥胖大鼠前额叶PPARγ-PI3K-Akt通路并促进神经可塑性相关蛋白表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2018年05期

3 黄小波;王宁群;陈玉静;梁伟;赵荣博;陈文强;;陈皮半夏通过PI3K-Akt通路对衰老脐静脉内皮细胞中p53和p21表达的影响[J];北京中医药;2017年09期

4 王智华;田首元;王建刚;贺萱;朱健;;自噬及PI3K-Akt通路在舒芬太尼后处理心肌缺血再灌注损伤保护中的作用[J];中西医结合心脑血管病杂志;2017年04期

5 徐磊;刘畅;李向农;;PI3K-Akt信号通路与大鼠肝脏缺血预处理保护作用关系的研究[J];医学研究杂志;2008年03期

6 李程;毕旭东;赵国伟;;丹参对大鼠肝缺血再灌注损伤PI3K-AKT信号传导通路的影响[J];中国老年学杂志;2012年05期

相关博士学位论文 前2条

1 杨少青;以胰岛素抵抗肝细胞模型筛选糖尿病药物及环烯醚萜苷类化合物降糖机制的研究[D];西北大学;2016年

2 王冰;游离脂肪酸增高致胰岛β细胞功能紊乱的机理研究[D];中国协和医科大学;2008年

相关硕士学位论文 前8条

1 朱文洁;MiR-1268b通过下调PI3K-Akt通路抑制乳腺癌化疗耐药[D];山东大学;2018年

2 杨春;Mfn-2表达和PI3K-Akt通路在七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用[D];山西医科大学;2017年

3 刘亚坤;骨形成蛋白4通过PI3K-Akt通路和自噬诱导H9c2心肌细胞肥大的机制[D];新乡医学院;2017年

4 高桐;赖氨酸氧化酶和血管内皮生长因子在缺氧微环境中促进乳腺癌发生上皮间质转化的机制研究[D];大连医科大学;2017年

5 黄后双;PI3K-Akt通路对ORFV复制及其感染宿主细胞凋亡过程的影响[D];吉林大学;2016年

6 方芳;白藜芦醇预处理对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤神经元的保护作用及其机制[D];安徽医科大学;2013年

7 徐海林;淫羊藿素通过PI3K-Akt和Nrf2通路拮抗肺泡Ⅱ型上皮细胞氧化应激的研究[D];复旦大学;2013年

8 贺芳;FoxO1调控鹅原代肝细胞脂质代谢作用研究[D];四川农业大学;2015年

本文编号：2697712