MG132诱导肝癌细胞凋亡和自噬的机制研究

发布时间：2020-06-09 00:38

【摘要】：背景肝癌(HCC)是一种没有明确临床病理学定义的恶性消化系统肿瘤,严重威胁人类的健康~([1-3])。HCC的复发率和死亡率高,5年生存率不到15%,而在中国为10.1%~([4])。在HCC患者中,男性多于女性。HCC的治疗方法有多种,最常用的有效治疗是手术切除和使用化疗药物如Sorafenib等~([5])。但是,手术切除对病人的身体伤害大,一般的化疗药物虽然有助于部分病人的病情,但是对于晚期HCC患者的治疗依然不乐观,所以需要寻找更好的和更有效的药物用于治疗HCC。HCC细胞具有无限增殖的特性,而蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitors,PIs)可以通过抑制肿瘤细胞的周期,阻止其无限增殖,PIs尤其可以选择恶性程度高的肿瘤细胞首先发挥毒性作用。因此,选择PIs治疗HCC是有希望的。MG132是PIs中的一种,更是一种天然的PIs。并且,已经证明MG132能够对HCC细胞发挥毒性作用~([6])。MG132对HCC细胞的毒性作用涉及多种途径,如p53、MAPK和AKT,以及多种基因如TRAIL等~([7-9])。但是MG132在治疗HCC细胞中的更加全面的调控机制并不是很清楚。为了MG132能够更早更好的应用临床治疗HCC,对MG132治疗HCC的调控机制进行更加深入全面的探讨是有必要的。SIRT2是一种去乙酰化酶,与一些E3泛素连接酶具有相互作用。SIRT2参与细胞的有丝分裂,通过细胞周期影响细胞的增殖。并且,SIRT2在HCC组织和细胞中高表达,与HCC的恶性程度呈正相关。有证据证明,慢病毒介导的SIRT2沉默能够抑制HCC细胞的增殖,说明SIRT2的下调将有助于HCC的治疗~([10])。但是,在使用MG132治疗HCC的过程中是否能够引起SIRT2下调,并没有研究。因此,为了全面地了解MG132在治疗HCC过程中的功能,在HCC细胞中展开对MG132和SIRT2的研究是有必要的。目的本研究通过初步探讨MG132在抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导SMMC-7721细胞的凋亡和自噬的调控机制,旨在阐明SIRT2在MG132处理SMMC-7721细胞过程中的作用。并且通过对MG132抑制SMMC-7721细胞增殖过程中机制的研究,为MG132治疗HCC提供更多的理论依据,最终将有助于治疗HCC新药物的开发。方法1.选取HCC细胞株SMMC-7721细胞做为研究对象,用MTT检测2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM浓度的MG132培养SMMC-7721细胞24 h的细胞活力。2.用20μM的MG132培养SMMC-7721细胞24 h,用hoechst33258染色检测是否有凋亡小体;western blot检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的变化;用MDC染色检测自噬小体;western blot检测自噬蛋白LC3I和LC3II的变化。3.选取20μM MG132培养SMMC-7721细胞6 h、12 h和24 h,用western blot检测SIRT2、LC3I、LC3II、ATG7、STAT3和P-STAT3的变化。4.SIRT2转染SMMC-7721细胞。5.20μM MG132培养正常、转染PCDNA3.1-HA质粒和转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒的SMMC-7721细胞株6 h、12 h、18 h和24 h,用MTT检测细胞的抑制率。6.20μM MG132培养转染PCDNA3.1-HA质粒和转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒的SMMC-7721细胞株24 h,用western blot检测LC3I和LC3II的变化;用MDC染色比较两种细胞自噬程度的差异;用细胞凋亡流式和hoechst33258染色比较两种细胞凋亡程度的差异。结果1.MTT结果表明,随着MG132浓度和时间的增加SMMC-7721细胞的增殖受到明显的抑制。2.MDC和hoechst33258染色以及western blot结果看出,使用20μM MG132处理SMMC-7721细胞24 h,与对照组相比MG132处理组细胞出现了的凋亡和自噬特征。3.选择20μM MG132培养正常SMMC-7721细胞6 h、12 h和24 h,SIRT2的蛋白表达水平在12 h和24 h出现了明显的下调;同时自噬相关蛋白ATG7表达上调和标志性蛋白LC3II表达上调;同时检测到P-STAT3下调。4.选择20μM MG132培养细胞24 h,MTT检测到正常细胞株和转染PCDNA3.1-HA质粒细胞株的抑制率高于转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒细胞株。5.选择20μM MG132培养SMMC-7721细胞24 h后,western blot、MDC染色、细胞凋亡流式和hoechst33258染色的结果显示,转染PCDNA3.1-HA质粒细胞株和自噬特征比转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒细胞株凋亡现象更加显著。结论1.MG132能够抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导SMMC-7721细胞凋亡和自噬。2.MG132通过下调SIRT2抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞的凋亡和自噬。
【图文】：

柱状图,细胞增殖,细胞,对数生长期

2 结果2.1 MG132 对 SMMC-7721 细胞增殖的影响为了观察 MG132 对 SMMC-7721 细胞增殖的影响，我们选取 2.5 μM、5 μM、10 μM20 μM、40 μM 和 80 μM 浓度的 MG132，培养对数生长期细胞 24 h，control 组为溶剂对照组。用酶标仪检测 OD 值，再用 Prim5 软件绘制细胞增殖柱状图。如图 2-1，用 2.μM、5 μM、10 μM、20 μM、40 μM 和 80 μM 浓度的 MG132 培养的 SMMC-7721 细胞与 0 μM 组比较活性明显减低，并且随着 MG132 浓度的逐渐增大，SMMC-7721 细胞的增殖抑制作用越明显。实验数据采用均数±标准差表示（n=3，，***P＜0.001，*P<0.05 vcontrol）。

核破裂,蛋白,对照组,相关蛋白

2 结果观察到了细胞核浓缩、核破裂以及凋亡小体等细胞凋亡特征。同样的培养条件和培养间，直接法收取的 3 种细胞蛋白，western blot 检测凋亡相关蛋白 cleaved-caspase3 的达水平，结果显示如图(2-2-B)，对照组与药物处理组均检测到了 caspase3，但是与阴和 DMSO 对照组相比，MG132 的浓度为 20 μM 培养的细胞收取的蛋白，检测到caspase3 的活化条带 cleaved-caspase3。结果表明，MG132 能够诱导 SMMC-7721 细胞亡。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】