基于测序数据的消化道Pan-Cancer小分子非编码RNA的研究与预后分子病理模型的构建

发布时间：2020-06-09 06:58

【摘要】：研究背景:2018年4月5日,国际顶尖学术期刊《细胞》发表了10篇癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)泛癌症图谱(Pan-Cancer Atlas)研究结果的论文。泛癌症图谱是整合基于不同肿瘤类型,不同平台的TCGA数据,不仅侧重于对肿瘤基因测序数据的分析,同时也对其他类型的数据,如蛋白组、临床以及影像方面的数据进行综合分析。消化道恶性肿瘤是侵害人类健康与生命的常见疾病。中国国家癌症中心(NCCR)公布我国2015年确诊的消化系统新增癌症病例总数为2,089,500例,占新增癌症的48.68%;消化系统肿瘤死亡人数1,565,500例,占癌症死亡人数的55.63%。我国消化道肿瘤的结直肠癌、胃癌、食道癌的发生率和死亡率均在前五之列。小分子非编码RNA(small non-coding RNA,sncRNA),特别是snoRNA与snRNA,过去认为它们在体内稳定表达,被广泛用于检测项目的内参。近年来发现这些sncRNA参与了肿瘤的发生发展的过程,一些snoRNA还被发现与肿瘤临床病例特征和预后相关。消化道恶性肿瘤的死亡率高,术后预后不佳,普遍存在较高的复发率及较差的五年生存率。而目前为数不多的预后研究以单个或少数几个领近区域的医疗单位为主要研究对象,样本数量不大、随访数据缺失多、准确度不高、可信度差以及预后指标单一等缺陷。临床上亟需有基于样本量大、可信度好、预测准确度高的消化道肿瘤患者预后分子病理模型。单个消化道肿瘤的分子研究已被广泛报道,但对消化道Pan-Cancer的综合性研究报道比较少见。小分子非编码RNA中的snoRNA和snRNA在肿瘤中的分子机制和作用以及临床预后价值还不是很清楚。测序数据中提供了丰富的高通量测序的基因表达数据以及生存时间等临床病理信息。本研究拟通过测序数据中消化道腺癌的基因表达数据,分析小分子非编码RNA(snoRNA、snRNA和miRNA)在消化道腺癌的分子作用及构建预后分子病理预测评估模型,揭示消化道腺癌的分子生物功能与临床预后价值。通过构建调控网络、蛋白互作网络及信号通路寻找肿瘤发生发展的一般规律,为肿瘤分子研究开拓新的思路。课题组前期通过测序数据挖掘消化道腺癌miRNA的表达谱发现,miR-7在4种消化道肿瘤中均表达上调。一些结直肠癌的研究表明miR-7在肿瘤组织中表达上调具有促进细胞增殖和肿瘤生长的作用,而另一些报道显示在结直肠癌中miR-7低表达,扮演着抑癌基因的角色。为明确miR-7在结直肠癌中的作用,本研究拟通过荧光RT-PCR实验验证miR-7-5p在结直肠癌蜡块组织中的表达情况,并通过体外细胞实验探索其细胞功能,为结直肠癌诊疗思路提供新的线索。研究材料和方法:本研究纳入2017年TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库内的消化道腺癌的小分子非编码RNA及mRNA的高通量测序的level 3表达数据及生存时间等临床病理信息,其中包括食道癌(esophageal carcinoma,ESCA)、胃癌(stomach adenocarcinoma,STAD)、结肠癌(colon adenocarcinoma,COAD)和直肠癌(rectal adenocarcinoma,READ)4类肿瘤。使用R语言的edgeR包筛选4种肿瘤的差异表达的miRNA、snoRNA、snRNA和mRNA。通过单因素和多因素COX风险回归模型筛选有预后价值的因子,并构建预后分子病理模型。通过miwalk2.0在线软件预测差异miRNA的靶基因与共同表达差异的mRNA取交集。构建miRNA-mRNA调控网络,对网络中的基因进行PPI蛋白互作网络分析,GO和KEGG信号通路分析和基因雷达分析。收集广西医科大学第一附属医院2017年7月至2017年11月结直肠肛门外科行结肠癌或直肠癌根治术的患者80对蜡块组织样本验证miRNA的表达。通过荧光RT-PCR验证结肠癌和直肠癌蜡块组织中miR-7-5p的表达水平;细胞功能实验采用中国科学院上海生命科学研究院提供的人结肠癌RKO细胞株。在结肠癌细胞通过慢病毒转染miR-7-5p抑制剂后进行MTT增殖实验、流式细胞周期检测和细胞凋亡实验研究其对结肠癌细胞功能的影响。通过生物信息学方法分析miR-7-5p在结肠癌中的分子生物作用。研究结果:通过消化道Pan-Cancer的基因表达谱及临床参数数据综合研究,在结肠癌中,构建了snoRNA(SNORD14E、SNORD67)组成的风险评分预后模型。在4种消化道腺癌中获得3个共同表达差异snRNA(RNU1-106P、RNU6-850P和RNU6-529P),以及具有预后价值的snRNA(RNVU1-4和RNU6-101P)。构建了以3个差异显著的miRNA(miR-552、miR-490和miR-133a-2)为核心的消化道腺癌miRNA-mRNA调控网络,并对网络中的基因进行PPI蛋白互作网络分析、GO和KEGG Pathway富集和基因雷达检测。在网络中发现PI3K-Akt signaling pathway等信号通路。此外,还筛选出具有预后价值的miRNA(miR-7-3、miR-328和miR-323a)。测序数据分析发现miR-7-3在4中消化道腺癌中高表达。通过荧光RT-PCR验证miR-7-5p的表达水平,显示其在结肠癌和直肠癌组织中表达上调。体外结肠癌细胞功能实验表明,抑制miR-7-5p的表达后,结肠癌细胞发生G2/M细胞周期阻滞及细胞增殖能力下降。通过生物信息学手段构建了miR-7-5p与核心靶基因的调控网络。研究结论:1.测序数据中4种消化道腺癌存在大量共同异常表达的miRNA、snoRNA、snRNA和mRNA分子,这些共同异常表达的生物分子可能在消化道腺癌中存在共同的作用机制。2.在结肠癌中,成功构建snoRNA(SNORD14E、SNORD67)组成的分子病理风险评分预后模型。3.在结肠癌中miR-7-5p起到致癌基因的作用。
【图文】：

分子研究,预后价值,肿瘤发生,信号通路

小分子非编码RNA（miRNA、snoRNA和snRNA）及mRNA在消化道腺癌的分子研究

数据库数据,信息,级别

图 1.1 TCGA 数据库数据信息Figure 1.1TCGA database data informationThe TCGA database has a data stock of 2.5 petabytes, and the amount of 1petabyte data is equivalenstorage of 212000DVDs. The study reached 33 types of cancer, including 10 rare types of cancer. Thnumber of patients studied more than 11000, including 7 different data categories.基于人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）的 TCGA 是最大规模的基因工程。TCGA 提供的数据类型包括：病人资料、治疗临床分期、肿瘤病理、存活情况；基因芯片和二代测序得到的 miRNA谱（miRNA Sequencing）、mRNA 表达谱（mRNA Sequencing）、蛋白量（Protein Expression）、遗传突变（Genetic mutation）、微卫星不（Microsatellite Instability，，MSI）、拷贝数变异（Copy Number）、DNA化（DNAMethylation）程度等。数据分为 4 个等级：级别 1 为原始测据；级别 2 为处理后数据；级别 3 为经过区域化和注释的数据；级别
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735

【参考文献】