低频低功率超声协同羟基磷灰石处理HepG2细胞的实验研究

发布时间：2020-06-09 16:09

【摘要】：目的:本文以低频低功率超声协同羟基磷灰石处理人肝癌HepG2细胞,探究其是否能达到抑制其生长的作用,初步探讨其抑瘤机制,为未来临床肿瘤治疗研究提供实验基础。方法:(1)搭建超声实验平台,采用液相合成法制备羟基磷灰石粒子。(2)以含羟基磷灰石(200μg/ml)的DMEM高糖培养基培养细胞,并以超声辐射频率(20kHz)、功率(P=0.1W/cm~2,0.2W/cm~2,0.3W/cm~2)、超声辐射时间(t=30s,60s,90s,120s,150s,180s)及超声处理后培养时间(T=0h,12h,24h,48h,72h)对人肝癌HepG2细胞进行超声辐射。以MTT实验检测HepG2细胞增殖抑制率,从羟基磷灰石粒子摄取、钙离子浓度检测超声的生物效应,另从细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬等方面对其抑瘤机制进行初步探索,EdU实验、Transwell实验检测经处理后的细胞的增殖、迁移及侵袭能力。(3)以羟基磷灰石粒子(200μg/ml)注入荷瘤鼠瘤体中,超声辐射频率(20kHz)、功率(P=0.1W/cm~2,0.2W/cm~2,0.3W/cm~2)、超声辐射时间(t=1min,5min,10min)处理肝癌荷瘤鼠,通过测量瘤体体积及体重,计算瘤体抑制率,待瘤体抑制率达到50%,停止超声辐射。取出瘤体,送检,并从细胞凋亡、自噬、坏死等方面探究其抑瘤机制。结果:(1)本节中所搭建的超声辐射平台,细胞实验中,将超声治疗头放置于去气水中,对细胞进行超声辐射,动物实验中,在超声治疗头上置以水套,对肝癌动物进行超声辐射,利用去气水可以更好的达到耦合和散热效果。其次本节所合成的材料为羟基磷灰石,且未检测到其它杂质,为高纯羟基磷灰石。其结构为短棒状,平均粒径较小,长径为100nm,短径在50nm,在纳米尺度范围内,且粒径大小均一,分布较为均匀,分散较好。(2)在超声及羟基磷灰石协同处理HepG2细胞后,MTT实验结果显示,HepG2细胞增殖抑制率随着超声功率的增加,超声辐射时间及培养时间的延长,呈现出先升高后降低的趋势,于羟基磷灰石(200μg/ml),超声P=0.2W/cm~2,t=90s,T=48h处,细胞增殖抑制率达到最高,此时以此参数组合处理的超声+羟基磷灰石组、超声组、羟基磷灰石组、对照组细胞凋亡率分别为(34.967±1.973)%、(4.967±1.872)%、(6.867±3.101)%、(3.633±0.569)%,超声+羟基磷灰石组的细胞凋亡率要明显高于其他三组,存在显著的统计学差异(p0.05)。此参数组合处理的超声+羟基磷灰石组、超声组、羟基磷灰石组、对照组细胞对羟基磷灰石摄取量分别为(71943.00±1847.171)%、(23708.00±96.348)%、(41532.67±399.830)%、(23473.00±113.450)%,超声+羟基磷灰石组的细胞对羟基磷灰石摄取量要明显高于其他三组,存在显著的统计学差异(P0.05)。此参数组合处理的超声+羟基磷灰石组、超声组、羟基磷灰石组、对照组细胞钙离子荧光值分别为(3514.33±266.294)%、(2003.33±114.159)%、(2616.33±62.692)%、(1428.33±166.929)%,超声+羟基磷灰石组的细胞钙离子荧光值要明显高于其他三组,存在显著的统计学差异(p0.05)。此参数组合处理的超声+羟基磷灰石组、超声组、羟基磷灰石组、对照组细胞增殖率分别为(14.040±1.310)%、(44.092±0.812)%、(47.132±1.455)%、(50.268±1.712)%,超声+羟基磷灰石组的细胞增殖率要明显低于其他三组,存在显著的统计学差异(p0.05)。此参数组合处理的超声+羟基磷灰石组、超声组、羟基磷灰石组、对照组,细胞迁移数分别为(24.83±4.262)(个)、(54.33±6.218)(个)、(64.00±7.694)(个)、(79.00±8.944)(个),细胞侵袭数分别为(44.60±4.159)(个)、(89.20±6.058)(个)、(99.40±7.162)(个)、(123.00±7.382)(个),超声+羟基磷灰石组的细胞迁移及侵袭数要明显低于其他三组,存在显著的统计学差异(p0.05)。以上结果表明,低频低功率超声协同羟基磷灰石具有抑制HepG2细胞生长的作用,且超声可促进羟基磷灰石粒子进入细胞内,增加细胞内钙离子浓度,促进细胞凋亡,还可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力。(3)于羟基磷灰石(200μg/ml),超声f=20kHz,P=0.3W/cm~2,t=10min,处理9天后,荷瘤鼠瘤体抑制率达到60.35%,在此参数组合处理的肝癌组织凋亡率(31.587±2.363)%与超声组(12.657±3.73)%、羟基磷灰石组(9.703±1.65)%、对照组(4.137±2.54)%相比存在显著统计学差异(p0.05),且HE染色结果表明,超声+羟基磷灰石组的肿瘤坏死程度明显高于其它三组。以此参数送检的器官HE染色中,心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏组织未见明显组织病理学改变。以上结果显示低频低功率超声协同羟基磷灰石具有抑制肝癌动物瘤体生长的作用,且对动物体内脏器无异常组织病理改变。结论:(1)以低频低功率超声协同羟基磷灰石处理肝癌HepG2细胞,可达到抑制HepG2细胞增殖的作用,并可达到促凋亡、抑制迁移及侵袭能力。(2)以低频低功率超声协同羟基磷灰石处理肝癌荷瘤鼠,可达到抑制瘤体增长的作用,未引起动物体内脏器异常组织病理改变。综上,低频低功率超声协同羟基磷灰石处理肝癌HepG2细胞及肝癌荷瘤鼠,均能达到抑制HepG2细胞增殖及荷瘤鼠瘤体生长的作用。其提示以超声结合羟基磷灰石的处理方式可为未来临床肿瘤治疗提供一种新的安全有效的、无明显副作用的癌症治疗思路。
【图文】：

示意图,技术路线,示意图

技术路线示意图

实验平台,声强,小儿科,峰值脉冲

第一章超声实验平台的搭建及羟基磷灰石制备及分析表 1.2 FDA 建议的人体内辐照处的最大允许声强用处 ISPTA(mW/cm2) ISPPA(W/cm2) or MI周围血管 720 190 1.9心脏 430 190 1.9胎儿成像及其他*94 190 1.9眼科 17 28 0.23：*包括腹部、小儿科、小器官（乳房、甲状腺、睾丸）、婴儿脑及成人脑；ISPTA：空间峰值时间平均空间峰值脉冲平均声强；MI：机械指数。验结果实验平台的搭建
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730.5

【参考文献】