α2,3-唾液酸化修饰在膀胱癌发生发展中的作用及分子机制

发布时间：2020-06-14 10:55

【摘要】：糖与核酸、脂类和蛋白质一样,都是组成细胞的重要成分。它不仅是细胞能量的主要来源,更在生命活动的调控方面起着非常关键的作用。研究发现,糖基化的异常修饰与肿瘤的发生发展密切相关。糖基化的修饰主要通过糖基转移酶的催化完成。糖基转移酶的异常表达在调节肿瘤发生发展中扮演着十分重要的角色,并能够作为生物标记物为肿瘤的干预治疗提供特异性靶点。唾液酸是一种带有负电荷的九碳单糖,常位于糖链末段,能够与细胞膜表面蛋白等结合,是传递生物学信息的重要分子。唾液酰基转移酶是一类糖基转移酶,它能够将唾液酸以α2,3-或α2,6-两种方式连接在Gal或Gal NAc上,或以α2,8-的连接方式结合在蛋白质上。根据转移唾液酰基后所构成的不同类型的糖苷键可将唾液酰基转移酶分为ST3Gal I-VI,ST6Gal I-II,ST6Gal NAc I-VI以及ST8Sia I-VI四类。目前发现许多肿瘤抗原中均存在唾液酸化修饰,而这其中主要的唾液酸化抗原是SLe A和SLe X,经证实它们在多种恶性肿瘤中均有不同程度的高表达,并与肿瘤预后不良有关。膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,在世界范围内都具有较高的发病率和死亡率,对其早期诊断和个性化治疗是治疗取得成功的关键,因此寻找一个有效的诊断及治疗靶点仍是当下研究的热点。然而目前,关于唾液酸化修饰在膀胱癌发生发展中的作用及分子机制研究尚少。一、目的1.揭示α2,3-唾液酰基转移酶在膀胱尿路上皮癌与正常膀胱尿路上皮中表达量的差异及其对膀胱癌病人生存率的影响;2.揭示α2,3-唾液酰基转移酶对膀胱癌细胞生长、增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响;3.阐明α2,3-唾液酰基转移酶介导膀胱癌细胞恶性生物学行为的分子机制。二、方法1.利用基因芯片对收集的临床样本进行全基因组表达谱分析;Real-time PCR,免疫组化,Western-blot等方法检测膀胱癌组织与正常膀胱尿路上皮中糖基转移酶的分布及表达差异;Kaplan-Meier统计学方法分析α2,3-唾液酰基转移酶对膀胱癌患者生存率的影响。2.利用Real-time PCR分析检测唾液酰基转移酶前家族成员在不同膀胱癌细胞系的表达水平;Western-blot检测ST3Gal4和ST3Gal6在不同膀胱癌细胞系与正常膀胱尿路上皮细胞之间的表达差异;通过脂质体转染、G418和有限稀释法构建筛选出稳定过表达ST3Gal4和ST3Gal6的5637和T24单克隆细胞株;Real-time PCR、Western-blot、流式细胞术及免疫荧光化学鉴定ST3Gal4和ST3Gal6在5637和T24细胞中的表达情况。3.利用CCK8、平板克隆、流式细胞术周期、划痕实验和transwell迁移侵袭等实验及检测α2,3-唾液酰基转移酶对膀胱癌细胞生长、增殖、迁移及侵袭能力的影响;裸鼠体内成瘤实验检测过表达ST3Gal4和ST3Gal6后膀胱癌细胞在体内成瘤能力的变化。4.通过Western blot研究α2,3-唾液酰基转移酶影响膀胱癌细胞恶性表型的分子机制并通过免疫组化染色检测相关分子的表达与定位。三、结果1.有多种糖基转移酶在膀胱癌组织中的表达水平具有差异,其中ST3Gal4和ST3Gal6表达差异显著,两者在膀胱癌组织中的表达量与正常膀胱尿路上皮相比均有不同程度下调,且其在膀胱癌组织中表达下调与患者预后生存率低相关;2.通过Western blot、免疫荧光、流式细胞术及Real-time PCR鉴定,已经成功构建稳定过表达ST3Gal4和ST3Gal6的膀胱癌细胞系。3.分别过表达ST3Gal4和ST3Gal6,均可抑制膀胱癌细胞在体外的生长、增殖、迁移及侵袭能力;体内实验显示:两者过表达后小鼠成瘤能力下降,肿瘤体积变小。4.ST3Gal4和ST3Gal6过表达可抑制MMP2、MMP9、AKT、P-S6K、m TOR及EIF4B等蛋白的表达水平。四、结论1.ST3Gal4和ST3Gal6在膀胱癌组织中表达量较正常膀胱尿路上皮中减少,其表达下调与患者肿瘤病理分级密切相关,低表达提示膀胱癌患者低生存率。2.ST3Gal4和ST3Gal6介导的α2,3-唾液酸化修饰增加能够抑制膀胱癌细胞在体内及体外的生长、增殖、迁移及侵袭能力。3.α2,3-唾液酰基转移酶对膀胱癌恶性行为的影响主要通过PI3K-AKT信号通路发挥作用。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.14
【图文】：

尿路上皮,膀胱癌,膀胱,免疫组织化学染色

大连医科大学硕士学位论文3. 检测 ST3Gal4 及 ST3Gal6 在膀胱癌组织中蛋白水平的表达情况为了探究 ST3Gal4 及 ST3Gal6 与膀胱癌病理特征之间的关系及其对膀胱癌发生发展的影响，我们通过免疫组化染色的方法在 107 例膀胱癌临床样本检测ST3Gal4 及 ST3Gal6 在不同病理分级的临床样本组织中的表达水平，同时通过Western blot 的方法检测 9 例膀胱癌组织样本中 ST3Gal4 及 ST3Gal6 中蛋白水平的表达情况。如图 1-3（A）所示，与正常膀胱尿路上皮组织相比，随着膀胱癌恶性程度的增加，ST3Gal4 及 ST3Gal6 蛋白的表达量呈下降趋势。如图 1-3（B）所示，通过对 9 例样本的组织进行 Western blot 检测，发现 ST3Gal4 及 ST3Gal6蛋白的表达量较正常膀胱尿路上皮组织减少，与 RNA 水平的检测结果一致，这一结果我们还需要进一步扩大样本量重复验证。

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Fig.2-3-1 Identification of recombinant expression vector pcDNA3.1(-)/ST3Gal4.图 2-3-1 重组表达载体 pcDNA3.1（-）/ ST3Gal4 的鉴定。-3-2 所示，利用 EcoRI/Hind III 双酶切和 DNA 测序鉴定 ST3G性克隆，测序反应由南京巴傲得生物科技有限公司提供并完成结果完全相符。

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