miR-494-3p在肺癌中作用机理和遗传型胃癌转录组分析

发布时间：2020-06-14 14:27

【摘要】：第一部分 miR-494在非小细胞肺癌中的功能与机理研究肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,具有很高的死亡率,随着近年来空气污染加重,肺部疾病已经严重影响人类健康和生活水平。由于目前癌症诊断技术发展的限制,肺癌确诊时期已经是中晚期,统计发现肺癌5年生存率不到15%。肺癌可以分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌两种类型,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占整个肺癌的80%以上,包括鳞癌和腺癌两种类型。做为常见的一种恶性肿瘤,虽然临床越来越多的科学研究者针对其诊断、治疗及预后等进行研究,但关于其早期诊断的精确性以及费用,有效精准治疗方向仍然需要进一步的研究与探索,因此目前非小细胞肺癌的新型诊断及机制研究显得尤为重要。miR-494能够在包括非小细胞肺癌在内的多种癌症中起到重要作用。尽管目前关于miR-494的研究已经初步揭示其功能,但是关于其作用机制仍然了解较少。在本次研究中,通过实时定量PCR发现非小细胞肺癌患者血清中miR-494含量明显高于正常人,在包括miR-125a、miR-125b、miR-101-3p在内的与非小细胞肺癌联系紧密的四种microRNA中,miR-494在癌症患者与正常人血清中差异最大,miR-125b无显著差异。我们选择差异最大的miR-494作为肺癌机制研究的对象,用Fisher精确检测分析miR-494含量与临床病例特征,其中发现其与临床病理分期(P=0.005)和淋巴结转移(P=0.001)均有明显的相关性。miR-494在非小细胞肺癌III-IV血清中含量明显高于I-II,以正常血清为对照,ROC曲线分析分别显示了其可能作为癌症分期诊断标志物的高灵敏性和特异性。细胞内用CCK-8实验、克隆形成实验及流式测其凋亡实验研究过表达miR-494之后的表型变化发现,miR-494能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖和克隆形成并降低顺铂的致死性。双荧光素酶标记实验证实miR-494能够靶向作用于CASP2并抑制其表达水平,不仅如此,siRNA敲低CASP2的表达能够促进细胞的增殖、降低顺铂的毒性及促进A549细胞的平板克隆形成。用过表达CASP2的回复实验验证,相对比过表达miR-494或者miR-494/pLVX-puro,过表达 miR-494/pLVX-CASP2 之后能够明显减缓 miR-494 的促增殖、促克隆形成作用,并且提高顺铂在细胞内的毒性。除此之外,western blot检测下游凋亡蛋白水解酶caspase-3和caspase-7裂解,流式细胞仪检测不同表达组合中A549细胞凋亡比例均能发现,caspase-2能够减缓miR-494对顺铂毒性的抑制作用。综合上述实验,我们对miR-494和CASP2在非小细胞肺癌中的功能进行了研究,首次发现miR-494能够通过调控CASP2的表达进而调控细胞增殖、平板克隆形成以及细胞对顺铂的灵敏性,在肺癌研究进展中存在着重要的意义。体外研究发现miR-494与非小细胞肺癌活性方面提供了新的功能和机制。这对于以后miRNA在某种癌症的表达量也许可作为某些特定耐药性的标志物或者治疗靶标提供了很有意义的素材。另外在A549细胞中中过表达miR-494做lncRNA芯片杂交,分析miR-494对非小细胞肺癌的细胞系中生物学过程的影响,KEGG信号通路分析发现,miR-494能够参与肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、NF-κB信号通路、凋亡信号通路的调节,为miR-494的研究提供了新的思路和方向。第二部分遗传型与非遗传型胃癌转录组分析在中国,胃癌引起的死亡占整个癌症死亡中的很大一部分比例。每年有70万人确诊胃癌,几乎占全球胃癌患者的一半,其中有小部分比例为遗传弥漫型胃癌。目前国际遗传型胃癌指定诊断标准为:(1)一代或二代亲属中有两个或两个以上的弥漫型胃癌病例,其中有一个人年龄小于50岁,或者(2)一代或二代亲属中有至少3个弥漫型胃癌患者,与年龄无关,或者(3)一个被诊断为弥漫型胃癌的患者,年龄小于40岁,或者(4)个体或者家族被诊断为弥漫型胃癌和小叶乳腺癌,其中1个年龄小于50岁。随着生物技术的快速发展,高通量基因表达检测的方法得到快速的应用,以RNA芯片杂交和二代测序为基础的检测为生物分子方向研宄提供了简洁有效的方法。为了探究胃癌遗传型在RNA水平的影响,我们选取遗传弥漫型胃癌组织做转录组分析,同时以非遗传型胃癌组织为参考,分析其中的差异。我们通过miRNA-seq研宄组织中miRNA的变化及其预测靶基因的生物学特点。GO分析两者miRNA靶基因在生物学过程、细胞组成成分及分子功能差异发现,两者未出现差异。对靶基因KEGG信号通路分析,遗传型胃癌miRNA靶基因更多的参与到神经调节的信号通路,非遗传肠型胃癌则参与到蛋白消化吸收及粘着连接等信号通路。我们用IncRNA芯片分析mRNA和IncRNA的差异变化,GO的生物学过程分析两者均集中在细胞分裂相关的生物过程,细胞成分和分子功能方向无大的差异。KEGG信号通路分析发现遗传型胃癌多参与到细胞周期、MAPK信号通路,非遗传肠型胃癌除细胞周期之外,明显差异富集在酒精中毒相关信号通路。通过遗传型胃癌与非遗传型胃癌RNA水平对比分析发现,其生物学过程、分子功能及细胞组成均未受到影响,参与信号通路的不同引起了种类及个体差异,为遗传型胃癌的研究提供了一个重要的研究方向。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2;R735.2
【图文】：

关学,位论,半胱氨酸蛋白酶,全称

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机制,缺失,位论,激活途径

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