DCLK1在MET和ERK5表达调控中的作用研究及其对恶性胸膜间皮瘤预后的影响

发布时间：2020-06-14 20:20

【摘要】：研究背景恶性胸膜间皮瘤(Malignant pleural mesothelioma,MPM)是一种起源于胸膜间皮细胞的高侵袭性肿瘤,与石棉暴露密切相关。MPM曾被认为是一种非常罕见的疾病,但在过去几十年中,MPM的发病率有逐年增加的趋势。有流行病学预测表明:恶性胸膜间皮瘤的发病率将在未来10年继续增加并达到高峰。每年全世界约有43000人死亡,预期到2020年死亡率也不会下降。从石棉暴露到发病,大概有30-40年的潜伏期。由于MPM缺乏典型症状、体征和影像学表现,单纯临床诊断仍旧比较困难。尽管手术联合放化疗、靶向治疗等综合治疗能提高间皮瘤患者的生存率和生活质量,但整体治疗效果不佳。由于MPM恶性程度高、侵袭性强、预后差,大多数患者生存率仍不足12-18个月,长期生存状况令人担忧。因此,MPM在较长时间内仍将是一个主要的公众健康难题,寻找新的、有效的药物仍为目前MPM防治的关键。MPM的发病机制复杂,涉及多种信号通路及分子的异常调控。上皮间质转化因子(mesenchymal-epithelial transition factor,MET)是由原癌基因MET编码的蛋白产物,是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体,属于酪氨酸激酶受体(Receptor tyrosine kinases,RTKs)超家族成员。酪氨酸激酶受体在肿瘤的生长、转移中发挥了重要作用。HGF是一种多肽生长因子,它诱导上皮细胞迁移、侵袭,参与免疫活性、组织再生及血管生成的调节。HGF与MET受体特异性结合后使MET的酪氨酸残基磷酸化,激活MET受体胞内的酪氨酸蛋白激酶,进而启动下游信号通路,从而促进肿瘤发生、侵袭和转移、血管新生、上皮-间质转化等过程。有研究表明,HGF通过激活PI3K/ERK5/Fra-1传导通路诱导恶性间皮瘤细胞增殖,而且HGF能促进间皮瘤细胞的磷酸化。阻断HGF/MET信号通路可有效抑制肿瘤的发生、发展和转移。细胞外信号调节激酶 5(extracellular regulated kinase5,ERK5)是 MAPK系统中的一个重要的一级激酶,ERK5信号转导通路也是MAPK信号转导通路中重要组成部分。通过ERK5信号通路的磷酸化级联反应,多种刺激因素激活MEKK3或MEKK2,再激活MEK5,最后激活ERK5,进而调节特定基因的表达。MEK5是ERK5唯一且特异性上游激酶,它对于ERK5激酶具有高度特异性,即使在MEK5过表达的情况下也不激活MAPK家族的其他成员。ERK5不仅可以促进细胞生存及抑制细胞凋亡等过程,而且与细胞的血管发育、增殖等功能密切相关。Ramos等研究发现恶性间皮瘤与ERK5信号通路有关。Doublecortin-like kinase 1(DCLK1)是一种跨膜微管相关蛋白激酶,编码的蛋白质具有DCX结构域和C末端的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。DCLK1被认为是一种新的胃肠道正常干细胞的标记物。抑制DCLK1的表达,就可抑制肿瘤组织生长。在肿瘤组织中,有多种转录因子、激酶、miRNA等参与了上皮间质转化过程。DCLK1阳性细胞具有更强的EMT,使肿瘤细胞具有更强的侵袭和转移能力。尽管DCLK1在许多肿瘤细胞中都有表达,但是目前关于DCLK1在恶性间皮瘤中的表达及其预后关系的研究却比较少,而且MET、ERK5和DCLK1之间的关系尚不明确。因此,本研究旨在探讨MET、ERK5和DCLK1是否可作为诊断恶性胸膜间皮瘤生物标记物的可能性,为MPM的免疫治疗提供新的靶向位点。研究目的:1.研究MET、ERK5和DCLK1在MPM细胞中的表达水平,阐明MET、ERK5和DCLK1作为诊断MPM生物标记物的可能。2.研究DCLK1的表达与MPM患者生存期的关系,阐明DCLK1可能是评价MPM患者预后的一个因素。3.通过细胞活性实验观察MET和ERK5抑制剂对MPM细胞增殖活性的影响。4.通过Western blot技术和RT-PCR技术,观察MET抑制剂或ERK5抑制剂在转录水平以及翻译水平对MET/ERK5/DCLK1通路调控的影响。5.研究MET抑制剂和ERK5的抑制剂与MPM的侵袭、转移的关系,为有效防治MPM提供药物治疗新靶点。研究方法:1.恶性间皮瘤组织及癌旁组织取自1997.7-2008.12加州大学旧金山医学中心结果确诊为MPM患者的标本。所取临床标本经加州大学旧金山医学中心伦理委员会审计批准。2.免疫组化方法:对73例组织标本的组织微阵列切片及间皮细胞瘤细胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常间皮细胞系LP9行免疫组化染色,明确MPM组织标本及细胞中MET、ERK5和DCLK1的表达情况。3.Celltiter-GloTM方法检测细胞增殖活性:细胞接种于96孔板培养,配制不同的XL184和XMD8-92药物终浓度后再细胞培养48h。加入CellTiter-GloTM试剂,检测板用GloMax-96微孔板多功能光度计进行读数,利用GraphPad Prism 6软件,计算IC50值,并绘制剂量-反应曲线。4.细胞迁移侵袭实验:经稀释的300 μ 1 Matrigel基质包被于6孔板小室中,收集药物处理后的细胞,无血清培养基制成细胞悬浮液,下室加入含10%血清的细胞培养基2.6ml,培养20h,取出小室,置于4g/L结晶紫的小孔内室温染色20min后显微镜下计数、照相。5.肿瘤细胞成球实验:收集药物处理后的单细胞悬液,将1× 103数量的细胞铺入24孔超低粘附培养板,加入无血清培养液,1周孵育后,10×倒置显微镜下计数肿瘤数目(直径超过60μm的肿瘤细胞)。6.Quantitative Real-time RT-PCR(qRT-PCR):使用 Rneasy Mini kit 试剂盒提取处理后细胞的总RNA,经逆转录反应合成cDNA后,再进行实时定量PCR反应,检测目的基因mRNA表达水平的改变。7.Western blot:使用细胞裂解液裂解处理后细胞,测定蛋白浓度,使其高温变性,再使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,最后应用免疫印迹检测目的蛋白的表达水平。8.统计学分析:符合正态分布的数值变量资料以均数±标准差(x ±s)表示;两组之间的比较使用t test;多组之间的比较使用单因素ANOVA Scheffe法;比较MET、ERK5和DCLK1在同一恶性间皮瘤细胞中IHC染色强度使用Chi-square检验;其他的数据分析使用 GraphPad Prism(Version 6.0;GraphPad Sof tware,San Di ego,CA,USA);总生存曲线绘制采用 GraphPad Pri sm 中的Kaplan-Meier分析。所有统计学数据P0.05被认为具有统计学差异。研究结果:1.MET、ERK5和DCLK1在MPM组织标本及细胞中过度表达(1)对73例组织标本的组织微阵列切片及间皮细胞瘤细胞系H290、H513、H28、211H、MS-1、H2052和正常间皮细胞系LP9行MET、ERK5和DCLK1的免疫组化染色。分析数据表明,在间皮瘤组织中,MET、ERK5和DCLK1三种蛋白均中度阳性和强阳性表达的为38.4%(n=28)。MET、ERK5和DCLK1之间的相关性分析表明统计学有显著差异(P0.05)。(2)在组织标本中对MET、ERK5和DCLK1行免疫组化评分,统计学分析表明,三者在间皮瘤组织标本的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织标本(P0.05)。2.DCLK1高度表达提示MPM预后不良(1)DCLK1在恶性间皮瘤组织中的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织,有明显的显著性差异(P=0.000409),表明DCLK1可能对恶性间皮瘤的发生有致瘤作用。(2)DCLK1在MPM肿瘤组织中的表达与患者临床病理资料的相关性分析:数据表明,DCLK1与患者的年龄、性别、吸烟状态和TNM分期之间均没有显著性差异(P0.05)(3)DCLK1表达和MPM患者总生存期(OS)之间的相关性分析DCLK1高表达者比低表达者总生存期明显缩短(P=0.0235),表明DCLK1的表达水平可能是影响MPM患者生存期的一个因素。3.MRT和ERK5的抑制剂能够抑制间皮瘤细胞的细胞增殖活性采用Celltiter-GloTM方法检测细胞增殖活性,在剂量-反应曲线上可检测到各细胞株的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)和细胞活性。IC50表明XL184和XMD8-92对不同的细胞系,有不同程度的抑制作用,其药物浓度越高,MPM细胞的活性就越低。XL184和XMD8-92分别对MET、ERK5高表达的MPM细胞灵敏度较高。4.MET或ERK5抑制剂可引起MET/ERK5/DCLK1通路DCLK1的下调(1)采用Wesestern blot技术,间皮瘤细胞经XL184或XMD8-92处理后,检测发现磷酸化MET、磷酸化ERK5和DCLK1的蛋白水平下降。(2)采用RT-PCR技术,间皮瘤细胞经XL184或XMD8-92处理后,检测发现DCLK1的mRNA水平明显降低,这些结果表明MET或ERK5的抑制剂能够降低MPM细胞磷酸化ERK5和DCLK1的表达。进一步说明了 DCLK1位于MET/ERK5信号通路的下游。5.MET或ERK5的抑制剂不仅能抑制H290细胞的迁移、侵袭,并且抑制H290细胞的肿瘤细胞成球能力(1)采用Transwell细胞迁移、侵袭实验观察MET和ERK5的抑制剂处理H290细胞,20小时后发现处理组H290细胞穿透小孔的能力均较空白对照组DMSO明显下降表明MET或ERK5的抑制剂能抑制H290细胞的迁移和侵袭。(2)采用肿瘤成球实验以观察MET和ERK5抑制剂对MPM肿瘤干细胞的自我更新能力的影响,表明H290细胞的球体形成的效率随药物的浓度的上升而下降,呈现出浓度依赖性。结论:1.本实验发现MET、ERK5和DCLK1在MPM肿瘤组织及细胞中高表达,且MET、ERK5和DCLK1在间皮瘤组织标本的表达水平明显高于正常胸膜间皮组织标本。2.在MPM患者中,DCLK1高表达者比低表达者生存期明显缩短,DCLK1有可能成为预测恶性胸膜间皮瘤预后的一个因子。3.研究DCLK1在MET和ERK5表达调控中的作用,阐明了 DCLK1位于MET和ERK5的下游水平。4.探讨MET/ERK5/DCLK1信号传导通路的活性可能在MPM细胞的生长过程中发挥重要作用。MET、ERK5和DCLK1可能作为恶性胸膜间皮瘤诊断标记物,为MPM的免疫治疗提供新的靶向位点,并且阐明小分子抑制剂可能为恶性胸膜间皮瘤提供新的治疗手段。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.3
【图文】：

恶性间皮瘤,间皮,阴性,中度

图１邋ＭＥＴ在人正常间皮组织与恶性间皮瘤组织标本中的ＩＨＣ染色结果逡逑（Ａ）邋ａ和ｂ正常间皮组织标本；ｃ－ｈ恶性间皮瘤组织标本：ｃ和ｄ染色阴性，ｅ逡逑和ｆ中度阳性染色，ｇ和ｈ强阳性染色。（Ｂ）间皮瘤细胞系：ａ和ｂ－－Ｈ２９０细胞逡逑强阳性染色；ｃ和ｄ—Ｈ５１ｌ强阳性染色；ｅ和ｆ—邋Ｈ２８细胞强阳性染色；ｇ和ｈ邋—２１１Ｈ逡逑强阳性染色；ｉ和ｊ—ＭＳ－１细胞染色阴性；ｋ和一Ｈ２０５２细胞阴性染色；ｍ和ｎ—ＬＰ９逡逑正常间皮细胞染色阴性。逡逑４３逡逑

恶性间皮瘤,间皮,阴性,中度

图２邋ＥＲＫ５在人正常间皮组织与恶性间皮瘤组织标本中的ＩＨＣ染色结果逡逑（Ａ）邋ａ和ｂ正常间皮组织标本；ｃ－ｈ恶性间皮瘤组织标本：ｃ和ｄ染色阴性，ｅ逡逑和ｆ中度阳性染色，ｇ和ｈ强阳性染色。（Ｂ）间皮瘤细胞系：ａ和ｂ—Ｈ２９０细胞逡逑强阳性染色；ｃ和ｄ邋—Ｈ５１３强阳性染色；ｅ和ｆ－邋Ｈ２８细胞中度阳性染色；ｇ和逡逑ｈ－－２１１Ｈ染色阴性；ｉ和ｊ－－邋ＭＳ－１细胞染色阴性；ｋ和１—Ｈ２０５２细胞阴性染色；逡逑ｍ和ｎ＿－ＬＰ９正常间皮细胞染色阴性。逡逑４４逡逑

【参考文献】