miRNA介导的SPIN1异常表达在乳腺癌耐药及浸润转移中的作用机制研究

发布时间：2020-06-15 01:20

【摘要】：研究目的:乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,也是女性癌症死亡的主要原因。我国女性乳腺癌发病率逐年上升,据估计到2021年我国55-69岁妇女的乳腺癌发病率将达到100/10万。化疗是乳腺癌治疗的重要手段,而肿瘤耐药性的产生是导致乳腺癌患者化疗失败的主要因素,并导致患者预后不良。此外,尽管乳腺癌治疗已取得显著进展,仍有30%乳腺癌患者面临转移复发的巨大威胁。一旦发生转移,乳腺癌通常是无法治愈的。深入揭示乳腺癌耐药及转移的分子机制,鉴定新的干预靶点,建立逆转耐药、控制转移的有效方法,一直是乳腺癌研究的重要课题。Spindlin1(SPIN1)是SPIN/SSTY家族的成员,其在卵巢癌和脂肪肉瘤中高表达,与肿瘤的发生发展相关。本课题组前期研究发现microRNA-489可抑制乳腺癌细胞的耐药性、增殖和迁移浸润能力,SPIN1是microRNA-489的直接靶基因。我们推测,SPIN1也可能在乳腺癌耐药及浸润转移中发挥重要作用。目前SPIN1在乳腺癌耐药及浸润转移中的作用及机制鲜有报道。本研究使用免疫组化的方法检测了 SPIN1在乳腺癌组织中的表达情况,分析了其与乳腺癌化疗反应、淋巴结转移等临床病理参数的关系。通过体内外功能学实验研究了 SPIN1对乳腺癌细胞耐药及浸润转移的影响,并使用基因表达芯片筛选、荧光素酶实验、western blot等手段初步探究了其可能的上下游分子机制。本研究有望为SPIN1成为乳腺癌诊疗靶点奠定基础。研究方法:使用免疫组化、实时定量PCR、生物信息学分析探究SPIN1在乳腺癌组织、细胞中的表达情况,分析SPIN1表达与患者临床病理参数及预后的关系。使用细胞增殖、凋亡、迁移浸润、耐药实验检测SPIN1、miRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响,裸鼠动物实验进一步在体内验证miRNA介导的SPIN1异常表达对乳腺癌化疗耐药的作用。使用基因表达芯片、pathway富集分析、实时定量PCR、western blot鉴定SPIN 1调节的靶基因及参与的信号通路。使用TargetScan、microRNA.org和starBase预测可能调控SPIN1的miRNA,通过荧光素酶实验及western blot验证miRNA对SPIN1的调节作用。进行细胞耐药实验探究miRNA对乳腺癌细胞耐药性的影响。利用网络数据库采用生物信息学方法分析SPIN1下游靶基因及上游miRNA的预后价值。结果:(1)SPIN1在乳腺癌中的表达情况免疫组化结果显示SPIN1蛋白在乳腺癌化疗耐药组织较化疗敏感组织表达上调,在伴有淋巴结转移的乳腺癌组织中表达高于不伴有淋巴结转移的组织。ROC曲线分析显示SPIN1表达可以明显地区分耐药组织与敏感组织,及有无淋巴结转移。临床病理参数分析提示SPIN1高表达与化疗耐药、淋巴结转移、T分期或临床分期、孕激素受体阳性相关。从GENT数据库获取了 GEO数据集GSE22513标准化后的数据,结果显示,相比于获得病理完全缓解(pCR)的病例,未获得病理完全缓解的病例(non-pCR)化疗前穿刺乳腺癌组织中SPIN1表达水平上调。此外,乳腺癌细胞系中SPIN1mRNA检测结果显示,MCF-7细胞中SPIN1表达水平最低;相比于化疗敏感、低转移性的MCF-7细胞,SPIN1在化疗耐药的MCF-7/ADM、高转移性的MDA-MB-231及MDA-MB-468中表达均明显升高。本课题组借助GOBO数据库分析了 SPIN1在多种乳腺癌细胞中的表达情况,结果显示SPIN1在三阴性乳腺癌细胞较Her2阳性或激素受体阳性细胞表达上调。利用 PPISURV、Kaplan Meier plotter、PrognoScan 在线软件分析了 SPIN1 表达与乳腺癌患者预后的关系,发现SPIN1高表达的患者相比于SPIN1低表达患者预后更差。(2)SPIN1对乳腺癌细胞生物学功能的影响实时定量PCR显示,与对照组相比,SPIN1过表达质粒转染可显著上调SPIN1的表达,而SPIN1 siRNA转染则显著地降低了 SPIN1的表达。细胞转染SPIN1过表达质粒或SPIN1siRNA后,进行细胞功能学实验,结果表明,SPIN1能够促进乳腺癌细胞的耐药性及迁移浸润能力,且抑制细胞凋亡。而SPIN1对乳腺癌细胞的增殖能力无明显影响。(3)SPIN1调节乳腺癌耐药及迁移浸润的机制研究在MCF-7/ADM细胞中转染SPIN1 siRNA或阴性对照之后进行差异表达基因分析,结果显示,相比于对照组,SPIN1siRNA组有4409个基因出现差异表达,其中2413个为表达下调,而1996个为表达上调。其中许多差异表达的基因富集在PI3K/Akt通路中。运用实时定量PCR、western blot进行验证显示PI3K/Akt通路中的关键分子PIK3CA、AKT、CREB1及BCL2是SPIN1的下游靶基因。为初步探究PIK3CA、AKT、CREB1及BCL2在乳腺癌耐药组织及敏感组织中的表达情况,我们进行了免疫组化检测,结果显示,PIK3CA、AKT、CREB1与BCL2在乳腺癌耐药组织较敏感组织表达上调。鉴于SPIN1在乳腺癌耐药中的重要作用,我们还关注了与药物代谢或转运相关的差异表达基因。选择了 ABC转运蛋白家族的部分成员(ABCA13、ABCB4、ABCC13和ABCC8)以及“药物代谢-细胞色素P450”通路中的基因(CYP2B6、CYP2C8、GSTA1、GSTA4、UGT2B11、UGT2B17 和 UGT2B4)进行验证。实时定量PCR及western blot结果显示,SPIN1可正向调控药物代谢酶CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17以及转运蛋白ABCB4的表达。利用网络数据库采用生物信息学分析了SPIN1 下游靶基因与乳腺癌患者预后的关系,发现PIK3CA、AKT、CREB1、BCL2、CYP2C8、UGT2B4、UGT2B17或ABCB4高表达的乳腺癌患者相比于低表达的患者预后要差。(4)SPIN1异常表达机制的初步探索本课题组先前的研究表明,在乳腺癌中,miR-489能够直接靶向SPIN1,负向调控SPIN1的表达,增强乳腺癌细胞化疗敏感性,而一个编码基因往往受到多个miRNA的共同调控。利用TargetScan、microRNA.org和starBase软件筛选靶向SPIN1 mRNA的3'-UTR的化疗耐药相关miRNA。结合文献报道我们挑选了 miR-148/152 家族的成员(miR-148a-3p、miR-148b-3p 和miR-152-3p)进行验证。荧光素酶实验及 western blot 证实 SPIN1 是 miR-148a-3p、miR-148b-3p 和miR-152-3p的直接靶基因,受其负向调控。miR-148a-3p、miR-148b-3p及miR-152-3p在乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM较敏感细胞MCF-7中表达下调。细胞耐药性实验表明miR-148a-3p、miR-148b-3p和miR-152-3p能够降低乳腺癌细胞的化疗耐药性。利用在线软件miRpower及MIRUMIR分析了miR-148a/148b/152-3p的预后价值,结果显示miR-148a/148b/152-3p低表达患者的预后不良。(5)动物实验验证miRNA介导的SPIN1异常表达在乳腺癌耐药中的作用及机制为了探究miRNA介导的SPIN1异常表达在裸鼠动物体内对乳腺肿瘤对阿霉素耐药性的影响,将稳定表达抑制SPIN1的miRNA(或其对照)的MCF-7/ADM细胞注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪垫下。结果显示,给予阿霉素后,转染miRNA组(SPIN1-low)的肿瘤体积明显小于对照组(SPIN1-high)。这表明miRNA介导的SPIN1异常表达在裸鼠体内增加乳腺癌细胞对阿霉素的耐药性。为了在裸鼠体内验证miR-489、miR-148/152-SPIN1-下游靶基因调控轴,我们在裸鼠瘤体组织中检测了上述分子的表达情况,并分析了其相关性。结果显示,SPIN1 的表达与 miR-489、miR-148-3p/148b-3p/152-3p 表达呈负相关。至于SPIN1下游的药物代谢酶和转运蛋白,我们发现瘤体组织中SPIN1和ABCB4、CYP2C8、UGT2B4 和 UGT2B17 的 mRNA 表达水平呈正相关。western blot结果显示,与SPIN1蛋白低表达的肿瘤相比,SPIN1蛋白高表达的肿瘤中ABCB4、CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17蛋白表达水平更高。结论及意义:SPIN1在乳腺癌耐药及转移性组织及细胞中表达上调,SPIN1高表达与乳腺癌患者预后不良相关。SP1N1通过正向调控PI3K/Akt通路、药物代谢酶CYP2C8、UGT2B4和UGT2B17以及转运蛋白ABCB4,进而促进乳腺癌细胞的耐药性及迁移浸润,抑制细胞凋亡。SPIN1 是 miR-148a-3p、miR-148b-3p 和 miR-152-3p的直接靶基因,受其负向调控。本研究首次对SPIN1在乳腺癌耐药中的作用及机制进行深入探讨,有望为SPIN1成为乳腺癌诊疗靶点奠定基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9
【图文】：

淋巴结转移,化疗耐药,蛋白,生物标志物

图１：邋ＳＰＩＮ１在乳腺癌耐药组织及伴有淋巴结转移组织中表达上调。（Ａ－Ｅ）乳腺逡逑癌化疗耐药组织较敏感组织ＳＰＩＮ１蛋白高表达（Ｐ邋＝邋０．０００９），伴有淋巴结转移组逡逑织较不伴有淋巴结转移组织ＳＰＩＮ１蛋白高表达（Ｐ邋＝邋０．０３３７）。（Ｆ－Ｇ）为了测试逡逑ＳＰＩＮ１在乳腺癌中作为化疗耐药及淋巴结转移的生物标志物的能力，建立了邋ＲＯＣ逡逑

淋巴结转移,乳腺癌,腺癌

在５５例乳腺癌新鲜组织中对ＳＰＩＮ邋１邋ｍＲＮＡ表达水平进行实时定量ＰＣＲ检逡逑测，结果发现，ＳＰＩＮ１在伴有淋巴结转移乳腺癌组织中较不伴有淋巴结转移组织逡逑中表达上调２．８倍（表２，图２，Ｐ邋＝邋０．０４３１）。而ＳＰＩＮ１与其它临床病理参数如逡逑年龄、组织学分级、肿瘤直径、临床分期、激素受体状态、ＨＥＲ２、Ｋｉ－６７、ｐ５３逡逑表达无明显关联；我们推测这可能有新鲜乳腺癌组织病例数目较少有关，ＳＰＩＮ１逡逑在新鲜乳腺癌组织中的表达情况有待在大样本中进一步探讨。逡逑表２．邋ＳＰＩＮ１在新鲜乳腺癌组织中的表达逦逡逑变量逦样本数逦表达量中位数逦Ｐ值逡逑年龄（岁）逡逑＜５０逦２４逦０．０００９逦０．１３３２逡逑＞５０逦３１逦０．００２２逡逑组织学分级逡逑Ｉ＋ＩＩ逦１９逦０．００４９逦０．３３３５逡逑ＩＩＩ逦１１逦０．００２６逡逑缺失逦２５逦０．０００６逡逑肿瘤直径逡逑＜３逦３３逦０．００２２逦０．２６１５逡逑＞３逦２１逦０．００１逡逑缺失逦１逦０．０３１７逡逑淋巴结转移逡逑阴性逦２５逦０．０００９逦０．０４３１逡逑阳性逦３０逦０．０

【参考文献】