YAP抑制剂的筛选及其抑制肝癌的功能和机制研究

发布时间：2020-06-18 17:08

【摘要】：Hippo信号通路是近年来发现的一条在器官大小发育和癌症发生发展等方面发挥重要功能的信号通路。Hippo信号通路的核心部分是由MST1/2和LATS1/2构成的激酶链。MST1/2激酶结合支架蛋白SAV1,磷酸化LATS1/2和MOB1A/B,促进LATS1/2和MOB1A/B之间的相互作用并激活LATS1/2的激酶活性。LATS1/2继而磷酸化Hippo通路下游的转录辅激活因子YAP及其同源蛋白TAZ。磷酸化的YAP/TAZ通过结合支架蛋白14-3-3被滞留在细胞质中,或通过泛素化途径被降解。当Hippo信号通路失活时,YAP/TAZ去磷酸化并进入细胞核与TEAD等转录因子结合,从而诱导促进细胞增殖和干性、抑制细胞凋亡的相关基因表达。在小鼠肝脏中特异性敲除Nf2、Sav1、Mst1/2或转基因表达Yap能迅速导致肝脏变大并进而导致肝癌发生。进一步研究表明YAP的激活不但通过细胞自主性的方式促进肿瘤,还能够通过招募巨噬细胞来对抗免疫监视,使肿瘤起始细胞能够免于被清除。对人肿瘤样品的研究也发现Hippo通路的变异对许多癌症的发生发展起到了关键的作用。例如NF2突变是二型神经纤维瘤最主要的抑癌基因突变;GNAQ/11突变在80%以上的葡萄膜黑色素瘤中发生;YAP的基因扩增在肝癌等多种癌症中被发现。同时研究发现YAP的激活不但促进肿瘤发生,还与肿瘤转移、复发等密切相关。因此学术界和生物医药界都对开发YAP的抑制剂作为抗癌药物的思路表现出了很大的兴趣。目前,靶向YAP活性的抑制剂研究虽然已经有了一些进展,但发现具有更高活性、更小毒性和更高成药性的抑制剂仍然任重道远。为了寻找YAP的小分子抑制剂,我们建立了基于报告基因的YAP活性检测体系,并对国家新药筛选中心的五万多种化合物进行了筛选。我们发现来自茜草科植物的天然环肽化合物RA-V抑制了 YAP和TAZ的报告基因活性。意外的是后续研究发现RA-V并不抑制内源YAP靶基因,例如CTGF和CYR61的mRNA水平,但是强烈抑制它们编码的蛋白的水平。这可能与以前在RA-V的类似物上被报道过的通过抑制EF1和EF2与核糖体的结合进而抑制蛋白质翻译的活性有关。由于YAP靶基因编码的蛋白是Hippo信号通路生物学功能的最终执行者,我进一步研究了 RA-V是否可以抑制YAP导致的器官变大和肿瘤发生。研究发现,在肝脏特异性Mst1/2双敲除小鼠模型中,RA-V显著抑制了肝脏的异常增大和肿瘤发生。另外,在YAP过表达诱导的小鼠肝癌模型中,RA-V不但抑制肿瘤发生,还能有效缩小已经形成的肿瘤。机制分析发现RA-V不仅抑制肝肿瘤细胞的增殖和去分化,诱导肿瘤细胞的凋亡,还能抑制微环境中免疫细胞的增殖,并诱导这些细胞的凋亡。而这些免疫细胞也是YAP诱导肿瘤起始所必须的。因此,RA-V通过直接抑制肿瘤细胞和改造免疫微环境抑制肝肿瘤。以上研究为RA-V用于治疗YAP/TAZ激活的肿瘤奠定了理论基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

质粒ＰＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ和ＣＴＧＦ启动子驱动的荧光素酶基因表达质粒逡逑ｐＧＬ４．２１－ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ组成，表徸的ＹＡＰ通过内源ＴＥＡＤ结合到ＣＴＧＦ启动子逡逑上，进而驱动荧光素酶基因的表达（图３．１Ａ）。为了降低背景信号，我们使用了仅逡逑包含２５０个碱基的ＣＴＧＦ启动子，该片段已经包含所有的三个ＴＥＡＤ结合位点。逡逑为了构建稳定细胞株，我们首先用表达潮霉素抗性的ｐＱＣＸＩＨ－Ｍｙｃ－ＹＡＰ质粒包装逡逑逆转录病毒感染ＨＥＫ２９３Ｔ细胞。在潮霉素筛选后对仍然存活的细胞转染表达嘌呤逡逑霉素抗性的ｐＧＬ４．２１－ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ质粒，然后用嘌呤霉素去筛选并挑单克隆扩逡逑增后进行荧光素酶活性检测。最终在多个单克隆中，我们选择了报告基因活性更逡逑高的单克隆４Ｄ１０邋（图３．１Ｂ）。为了验证该报告基因体系的灵敏度，我们分别检测逡逑了敲低ＹＡＰ表达和已知ＹＡＰ抑制剂处理条件下报告基因体系活性的变化。结果显逡逑示用ｓｈＲＮＡ敲低ＹＡＰ的表达水平（图３．１Ｃ），或使用干扰ＹＡＰ与ＴＥＡＤ结合的逡逑化合物Ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｍ邋（ＶＰ）处理（图３．１Ｄ）均显著抑制报告基因活性，说明该报告逡逑基因体系可以准确反映ＹＡＰ活性。因此该细胞克隆可被用于后续筛选。逡逑５８逡逑

光素酶活性的抑制率大于６０％，细胞活力大于８０％的筛选标准，挑选出５６个细胞逡逑毒性相对较低且抑制效果相对明显的阳性化合物。为了便于后续实验，我们将这逡逑些化合物依次编号为１？５６邋（图３．２Ｂ）。逡逑Ａ邋＾逦逡逑？２＊＆邋２＆４ｊ邋Ｉ逡逑２３Ｔ邋２＜ＪＪ邋ｉ逡逑■２２６邋？Ｗ｜邋｜逦Ｂ逡逑＇邋■逡逑２０＊邋Ｋ）９｜邋Ｉ逡逑？邋１０３，９６１邋ＳＬ逦１６０邋Ｉ￣￣；—￣ｉ逦逡逑＇—－１８１邋１６Ｔ］邋■■逡逑＾逦１７０邋１Ｔ６１邋￡逦匕邋１４０邋１邋火逡逑．＞邋，ｕｓ邋ｉｓ５｜邋ｍｍ逦＿＞＾逦＇？逦２邋＊逡逑＾逦＾＊＞３１逦？0邋１２０邋、：？？备邋＊拿’逦？逡逑Ｈｉ逡逑？邋以丨邋ａｓｓｓｓｓｒ－逦２0逡逑０邋１－＾逦逦－Ｊ逡逑逦逦＿逦０逦５０逦１００邋１５０邋２００邋２５０邋３００逡逑２：邋？逦，逦邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｌｕｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ（％）逡逑８逦０逦Ｏ逦Ｏ逦Ｏ逦Ｋ３逡逑＾逦°逦°逦８逦Ｓ逦Ｓ逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｗｅｌｌｓ逡逑图３．２使用ＹＡＰ／ＣＴＧＦ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ报告基因体系对化合物进行高通量初筛及初筛阳逡逑性化合物验证。Ａ，高通量初筛实验中各相对荧光素酶活性区段的孔的数量分布。逡逑每个区段的宽度为５．６％，星号标注的区域相对荧光素酶活性小于３０％。Ｂ，初筛逡逑结果的验证实验中

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本文编号：2719573