PDLIM5调控前列腺癌细胞增殖转移的机制研究

发布时间：2020-06-20 11:46

【摘要】：一、研究背景:前列腺癌(prostate cancer,PCa)是中老年男性常见的泌尿系统恶性肿瘤,目前在全球范围内PCa的发病率和病死率在所有男性肿瘤中分别居于第2位和第6位。特别在发达国家的男性中,PCa已成为发病率最高的肿瘤,根据2018年最新的癌症统计数据,美国每年估计有164,690例的PCa新发病例,并导致每年约29,430人死亡。相对西方国家,亚洲区域PCa发病率和病死率较低。中国PCa发病率及病死率虽低于世界平均水平,但随着近年以前列腺特异性抗原(PSA)筛查为代表的前列腺癌早期筛查技术普及,中国PCa的发病率正快速升高。据2015年最新公布的数据显示,我国PCa发病率达60.3/10万人,位于男性恶性肿瘤发病率的第6位,且有逐年增高的趋势,PCa死亡率高达26.6/10万人。早期筛查使得在大多数患者在前列腺癌早期被发现,通过根治性治疗提供相对有利的预后并获得长期存活。然而,许多患者首诊即为中晚期前列腺癌或因肿瘤复发并最终进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),尽管标准化使用雄激素剥夺疗法(ADT)可以延缓局部晚期或转移性PCa患者的疾病进展。但这些患者的治疗方法有限,预后通常较差。肿瘤转移是导致90%癌症相关死亡的原因,PCa是最容易发生骨转移的人类癌症之一,CRPC患者,特别是转移性CRPC(mCRPC)患者能够从ADT疗中获益有限。因此,探索PCa发生转移的潜在途径并寻找针对前列腺癌转移的新的有效的生物分子靶点,以便制定更好的CRPC治疗方法及肿瘤骨转移的预防策略为近年来研究的热点。PDLIM5(PDZ和LIM结构域蛋白5,PDZ and LIM domain protein5,PDLIM5)是由N-末端的PDZ结构域和C-末端的三个连续的LIM结构域组成的63kDa的细胞质蛋白,由Kuroda等人于1996年通过以蛋白激酶C(PKC)为诱饵蛋白的酵母双杂交技术首次发现。PDLIM5可通过其PDZ结构域锚定于肌动蛋白细胞骨架并招募肌动蛋白丝相关蛋白。因此PDLIM5被认为参与细胞骨架结构组成,细胞系分化,器官发育和肿瘤形成。由于已有实验研究证实PDLIM5的功能主要与调节突触强度的功能有关,故大量的研究集中在PDLIM5与精神疾病如精神分裂症和抑郁症之间的关联上。此外,PDLIM5被认为是细胞迁移形成板状伪足所必需的:PDLIM5通过磷酸化调节失活后,可过灭活Rac1(Rho家族蛋白)来削弱细胞转移能力。在肿瘤的形成和转移方面,根据最近的研究,PDLIM5可能参与多种癌症的发展,包括甲状腺癌、肺癌、乳腺癌及胃癌。Koutros等报道,通过使用基因芯片检测,PDLIM5 mRNA在PCa组织中过度表达。Ma W等报道,PDLIM5可能被证明是血清和尿液分析辅助诊断的分子靶点,并且在预测晚期前列腺癌进展风险方面具有潜在价值。目前已知细胞迁移侵袭与细胞骨架的动态变化紧密相关:细胞骨架的排列,特别是含有肌动蛋白的微丝骨架重塑是决定细胞形态和运动性的关键因素。PDLIM5是明确的细胞骨架相关蛋白,可能在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用,因此了解PDLIM5在前列腺癌发生、发展和转移中的分子机制将有助于改善PCa,特别是处于CRPC阶段前列腺癌患者的治疗方法及预后。AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)为常见的能量受体复合体,其可在缺氧,缺血再灌注,葡萄糖供给不足等应激条件过程中被激活。研究表明AMPK的激活与肿瘤生长和增殖,细胞周期,凋亡,血管形成和转移紧密相关。在这项研究中,我们发现通过数据挖掘和实验研究,PDLIM5在PCa组织中较正常前列腺组织高表达。另外,PDLIM5可以通过与AMPK结合并发挥生理功能。因此,我们利用表达短发夹RNA的慢病毒,在PC-3和DU145细胞中沉默了PDLIM5基因,观察了癌细胞的功能表型变化,揭示了PDLIM5的PCa肿瘤发生的潜在调控机制。二、实验目的通过研究PDLIM5在前列腺癌组织及细胞系中的表达水平,验证PDLIM5在前列腺癌中的异常高表达。筛选高表达PDLIM5细胞株进一步进行生物功能学实验,以探索PDLIM5介导肿瘤发生及转移的生物学功能及调控机制。三、实验方法(一)PDLIM5在前列腺癌相关芯片数据库中表达分析及组织标本验证收集Oncomine、PROGGENE数据库中的前列腺癌样本中PDLIM5表达、转移及预后相关信息,验证PDLIM5在癌和正常腺体中的表达差异,明确高表达PDLIM5与PCa转移预后的相关性。进一步收集长征医院泌尿外科前列腺癌根治术后临床组织样本44例,运用免疫组织化学染色法检测癌和癌旁组织标本明确PDLIM5组织表达水平。(二)前列腺癌PDLIM5敲减细胞株筛选及构建与沉默效率验证在PCa常见细胞系中通过Western Blot和qPCR分析PDLIM5的表达情况,选取高表达PDLIM5的转移性PCa细胞株DU145和PC-3作为后续实验对象,构建包含靶向干扰PDLIM5的质粒的慢病毒进行细胞感染。观察质粒上的报告基因荧光强度,并分别在mRNA及蛋白水平验证PDLIM5的敲减效率,确认沉默PDLIM5的细胞株构建成功。(三)检测PDLIM5沉默后前列腺癌细胞株增殖、细胞周期凋亡水平变化及对侵袭转移能力影响在稳定沉默PDLIM5的DU145和PC-3细胞中,通过MTT比色法、克隆形成试验来评估肿瘤细胞增殖能力的变化;通过细胞流式术检测细胞周期及凋亡水平变化以明确PDLIM5敲减后对肿瘤细胞的周期阻滞及诱导凋亡作用;通过划痕愈合实验及TRANSWELL实验来检测PDLIM5对肿瘤迁移侵袭的影响。(四)PDLIM5对前列腺癌增殖转移调控机制的初步探究根据细胞表型相关实验结果及数据库信息分析,PDLIM5对肿瘤细胞的转移侵袭能力具有显著影响。我们首先在PDLIM5沉默状态下通过Western Blot和qPCR对上皮细胞-间充质转化(EMT)相关分子进行了检测,随后通过构建过表达质粒,在同种细胞株中过表达PDLIM5,检测EMT相关分子表达回复情况,并分别在PDLIM5敲减及过表达两种情况下对前列腺骨转移相关分析因子进行检测。最后通过免疫共沉淀,确定PDLIM5与AMPK的相互作用并对敲减PDLIM5后AMPK磷酸化水平进行检测,探索PDLIM5-AMPK-EMT的调控机制。(五)动物实验研究PDLIM5在体内功能作用使用沉默PDLIM5的DU145细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,观察体内环境下PDLIM5敲减后对细胞成瘤及增殖能力的影响。随后将取瘤体组织进行裂解,通过Western Blot对PDLIM5蛋白表达水平进行检测,明确PDLIM5的沉默效率并检测AMPK、EMT相关信号通路分子表达变化,明确在动物实验中PDLIM5对细胞增殖转移的调控机制。四、实验结果1.发现PDLIM5在PCa组织中异常高表达,并且与PCa生化复发与生存期相关。通过免疫组化及生物信息学分析方法,确认PDLIM5在PCa中较正常前列腺组织表达水平升高,且深入分析数据库芯片资料发现异常高表达的PDLIM5与预后不良因素如:转移、高Gleason评分及TMN分期相关。同时,通过多因素分析及生存分析发现高表达PDLIM5是PCa生化复发的独立危险因素并导致患者总生存率下降。2.成功建立稳定沉默PDLIM5的DU145及PC-3细胞株,通过相关细胞学实验发现沉默PDLIM5可导致前列癌细胞恶性增殖、克隆形成、侵袭转移能力受抑制,并可诱导G2/M阻滞和细胞凋亡的发生。3.检测PDLIM5敲减后上皮-间质转化(EMT)相关分子表达水平,通过WesternBlot及qPCR发现人紧密连接蛋白1(ZO1)、波形蛋白(Vimentin)、SNAIL等出现不同程度下调,而EMT关键分子E-cadherin表达量上升,证实EMT过程受到抑制。4.在DU145及PC-3细胞中过表达PDLIM5可以在一定程度上通过上调SNAIL的表达,从而使及关键分子E-cadherin表达量下降,证实PDLIM5对细胞侵袭和转移的影响与EMT密切相关。同时在细胞实验中检测已知促进前列腺癌骨转移的相关分子,如结缔组织生长因子(CTGF),甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)。qPCR结果显示,沉默PDLIM5后,PC-3细胞中这些促肿瘤转移因子的表达显着下调。当PDLIM5过表达时,这些分子的表达水平出现上调,且在DU145细胞中也观察到类似的结果,进一步证实PDLIM5在促进肿瘤转移中起作用5.免疫共沉淀确定PDLIM5可与AMPK相结合,敲减PDLIM5后AMPK蛋白及磷酸化AMPK蛋白水平下降。随后通过放线菌素阻断上游蛋白质合成,在给药后不同时间点检测AMPK蛋白水平,结果发现PDLIM5沉默组AMPK蛋白降解加快。即PDLIM5可通过维持AMPK的稳定性,使AMPK通路持续性激活,从而促进前列腺癌的恶性增殖及转移。6.裸鼠成瘤实验证明在体内条件下,沉默PDLIM5可抑制肿瘤细胞生长。通过组织蛋白水平检测,在动物实验中PDLIM5同样可通过AMPK-EMT相关通路对前列腺癌细胞增殖及转移进行调控。五、实验结论本研究证实了PDLIM5表达水平在PCa组织中发生上调,表明PDLIM5可能是PCa形成中的致癌基因。通过生物信息学分析探索PDLIM5与PCa复发和转移的关系,表明高表达PDLIM5是前列腺癌预后不良的相关因素。此外,细胞和动物实验都表明,PDLIM5通过激活AMPK通路可以促进癌细胞的增殖并增强EMT介导的侵袭和转移。探索PDLIM5相关相关通路及作用靶点可能有助于丰富PCa的进展和转移机制,并为mCRPC患者带来新的治疗策略。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25
【图文】：

表达水平,芯片

经过数据库限定条件进行搜索，剃除DNA表达数据芯片，共有12组芯片数据中PDLIM5在前列腺癌中较正常前列腺腺体高表达，将这12例数据芯片结果进行汇总，结果如图1所示，其中红色代表PDLIM5在癌组织中高表达，蓝色代表低表达，且颜色越深代表差异性更显著。图1．PDLIM5 mRNA表达水平在PCa组织中显著升高。对ONCOMINE数据库12个独立数据芯片进行汇总发现无论单个芯片数据还是整合的荟萃分析中，PDLIM5均在前列腺癌组织中异常高表达。选取数据芯片来源如图所示，荟萃分析统计量P<0.001，MedianRank：44.5。我们选取Lapointe Prostate、Luo Prostate、Welsh Prostate、Arredouani Prostate 4个芯片对PDLIM5单个表达水平进行摘录，重新进行绘图并统计分析，同样证实PDLIM5在这个4个数据芯片中的癌组织表达水平升高，如图2.

芯片,数据库,免疫组化方法,差异表达

图2. Oncomine数据库中4个代表性基因芯片中的PDLIM5在PCa与正常腺体中的平比较情况。（二）免疫组化方法在组织标本中验证 PDLIM5 在前列腺癌腺体组织中差异表达在数据库中，我们初步证实了PDLIM5在PCa中表达水平升高，为进一步在组织行PDLIM5的验证，为下一步细胞学实验打下基础，我们利用免疫组化方法在患者组织中对PDLIM5表达水平再次验证。经过染色拍照评分，PDLIM5在癌及织中差异性表达结果如表一所示。

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