细胞缝隙连接通讯在CAFs调控非小细胞肺癌恶性进展中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-02 18:02

【摘要】：目的:研究细胞缝隙连接通讯(Gap junction intercellular communication,GJIC)在肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)调控非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)恶性进展中的作用及其机制。方法:1.采用组织块贴壁培养法从原发性NSCLC患者手术切除的癌组织及癌旁组织标本分别分离原代CAFs细胞和配对正常成纤维细胞(Normal fibroblasts,NFs);通过免疫印迹(Western blot,WB)和免疫荧光检测CAFs标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白-α(Fibroblast activation protein-α,FAP-α)的表达水平,通过胶原收缩实验检测CAFs的胶原收缩能力。2.用绿色荧光(GFP)标记NSCLC细胞株A549和H1299,构建CAFs和NSCLC-GFP细胞直接接触共培养体系,并用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)分选带GFP的NSCLC和阴性的CAFs细胞进行后续实验。3.通过WB、划痕法和Transwell小室法分别检测与CAFs共培养后NSCLC细胞的E-钙粘蛋白(E-caherin)和N-钙粘蛋白(N-cadherin)的蛋白表达水平、迁移能力和侵袭能力。4.使用细胞接种荧光示踪法(Parachute assay)检测CAFs同种细胞间、NSCLC同种细胞间以及CAFs与NSCLC异种细胞间的GJIC;采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,q RT-PCR)、WB和免疫荧光分别检测在哺乳动物肺组织或细胞表达的四种主要的缝隙连接蛋白(Connexins,Cxs)亚型Cx26,Cx32,Cx31.1和Cx43在CAFs和NSCLC细胞上的m RNA表达水平、蛋白表达水平和亚细胞定位。5.构建Cx43慢病毒过表达载体(Ubi-MCS-EGFP-IRES-puromycin)及Cx43慢病毒干扰载体(h U6-MCSubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),再分别感染CAFs和NSCLC细胞,然后用梯度浓度的嘌呤霉素连续作用筛选2周,筛选出稳定过表达Cx43的细胞株和稳定干扰Cx43表达的细胞株,WB检测上述细胞中Cx43的蛋白表达水平。6.在CAFs及NSCLC细胞中分别使用GJIC抑制剂18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid,18α-GA,4μM)或GJIC增强剂全反式维甲酸(All-trans-retinoic acid,RA,1μM)预处理48小时,再用Parachute assay检测上述CAFs与NSCLC细胞间的GJIC,并分别与同时在CAFs和NSCLC细胞上干扰或过表Cx43后的GJIC比较。7.划痕法和Transwell小室法分别检测与CAFs共培养后NSCLC细胞的迁移能力和侵袭能力;用WB检测与CAFs共培养后NSCLC细胞中EMT转化中上皮细胞标记物E-caherin、间质细胞标记物N-cadherin的蛋白表达情况和PI3K/AKT、MAPK/ERK信号通路的磷酸化水平。8.划痕法和Transwell小室法分别检测使用抑制剂LY294002和U0126分别抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路后,NSCLC细胞的迁移能力和侵袭能力。结果:1.光镜下显示,CAFs、NFs形态相似,均呈典型成纤维细胞状态,表现为梭形,细胞体积较大,核小,核仁不明显,胞质少;WB结果显示,相比配对NFs,CAFs高表达其标志物α-SMA和FAP-α;免疫荧光也显示,相比配对NFs,CAFs细胞高表达其标志物α-SMA和FAP-α;胶原收缩实验显示,相比配对NFs,CAFs细胞有较强的胶原收缩能力。2.光镜下显示,与CAFs共培养后,NSCLC细胞呈现上皮细胞的鹅卵石形态,变得明显拉长、细胞间连接变疏松;WB结果显示,与CAFs共培养后,NSCLC细胞上皮细胞标记物E-cadherin蛋白表达明显减少而间质细胞标记物N-cadherin蛋白表达明显增强;Transwell小室法和划痕法结果也显示,与CAFs共培养后,NSCLC细胞侵袭、迁移能力增强。3.Parachute assay结果显示,CAFs、NSCLC细胞均能有效传递荧光染料Calcein-AM到周围同种细胞(平均传递细胞个数分别为:10.33±1.53(SD),11.33±3.06(SD)和12.00±3.61(SD))。尤其是CAFs能传递Calcein-AM给NSCLC细胞(平均传递细胞个数分别为:20.67±3.229(SD)或24.00±2.65(SD))。但NSCLC均无法传递Calcein-AM给CAFs。4.q RT-PCR、WB结果显示,在CAFs和NSCLC细胞中,Cx26和Cx43是主要表达的Cxs亚型。免疫荧光结果显示,Cx43蛋白聚集在CAFs的胞膜和NSCLC细胞的胞膜及胞浆,而Cx26、Cx31.1及Cx32蛋白聚集在CAFs和NSCLC细胞的胞浆。5.Parachute assay结果表明,干扰CAFs和/或NSCLC细胞的Cx43表达,能够显著减少从CAFs到NSCLC细胞的单向GJIC;相反,过表达CAFs和/或NSCLC细胞的Cx43表达,能够显著增加从CAFs到NSCLC细胞的单向GJIC。此外,相比单独在CAFs或单独在NSCLC细胞过表达Cx43表达,在CAFs和NSCLC细胞共同过表达Cx43能进一步增强CAFs到NSCLC的单向GJIC。6.WB、划痕法和Transwell小室法显示,使用GJIC抑制剂18α-GA 4μM预处理CAFs和NSCLC细胞48小时(抑制GJIC而不影响CX43蛋白表达水平)可明显逆转CAFs诱导的NSCLC细胞的EMT转化、迁移和侵袭能力,并且这种抑制作用与在同时干扰CAFs和NSCLC细胞同时干扰Cx43(抑制GJIC并抑制CX43蛋白表达)程度相似。另一方面,使用GJIC增强剂RA 1μM预处理CAFs和NSCLC细胞48小时(增强GJIC而不影响CX43蛋白表达水平)可明显增加CAFs诱导的NSCLC细胞的EMT转化、迁移和侵袭能力,并且这种增强作用与在CAFs和NSCLC细胞同时过表达Cx43(增强GJIC并增强CX43蛋白表达)程度相似。7.WB结果显示,相比单独培养的NSCLC细胞,与CAFs共培养后NSCLC细胞的磷酸化Akt和ERK水平明显增强;分别在CAFs和NSCLC细胞同时干扰Cx43抑制GJIC或在CAFs和NSCLC细胞同时过表达Cx43增强GJIC后,与CAFs共培养的NSCLC细胞分别呈现磷酸化Akt和ERK水平的减弱和增强。8.划痕法和Transwell小室法显示显示,分别使用抑制剂LY294002和U0126抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路后,均可抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭能力并且抑制程度相似;联合使用两种抑制剂LY294002和U0126可协同降低NSCLC细胞的迁移、侵袭能力。结论:Cx43组成的CAFs到NSCLC细胞的单向GJIC介导了CAFs调控NSCLC细胞EMT转化、侵袭和迁移,其机制与CAFs通过GJIC依赖的方式激活NSCLC细胞的PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路有关。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2
【图文】：

从我校附属肿瘤医院胸瘤外科的原发性NSCLC患者手术切除组织中分别分离CAFs 、NFs进行原代培养和鉴定。成纤维细胞有选择性优势生长，经0.25%胰酶消化传代2次后，可获得纯化的CAFs和NFs细胞。如图1-1所示，纯化后的CAFs、NFs呈典型成纤维细胞状态，表现为细胞形态梭形，细胞体积较大，核小，核仁不明显，胞质少； Western blot和免疫荧光检测结果显示，相比配对NFs，CAFs高表达其标志物α-SMA和FAP-α（P<0.01）见图1-1和图1-2，CAFs上述效应可以至少维持至5代（结果未展示）。胶原收缩实验显示，CAFs有较强的胶原收缩功能（n为患者标本编号

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本文编号：2738510