SIRT1通过下调ARHGAP5的表达抑制胃癌的浸润和转移

发布时间：2020-07-11 01:39

【摘要】：研究背景胃癌是我们人类最常见的恶性肿瘤之一,是引起人类肿瘤死亡的常见原因。据报道虽然胃癌的发病率与死亡率一直处于下降趋势,但探寻其防治和治疗的方法仍然是世界范围内备受关注的话题。由于我们缺乏癌前和癌症早期的诊断方法,病人常常错失治疗的最佳时期。目前对于胃癌患者首选的治疗方式是手术切除,后期治疗过程中辅助放疗和化疗,然而对其手术后的生存及预后进行追踪发现效果并不乐观。目前看来,浸润转移是当前肿瘤治疗的瓶颈所在,一旦病变进入晚期或转移阶段,我们当前的治疗策略基本上是无效的。因此迫切地的需要我们了解胃癌转移的分子机理,以提高病人的预后。SIRT1是sirtuin家族的成员之一,是酿酒酵母中Sir2的哺乳动物同源物,而Sir2是酵母中第一个被发现的进化保守的长寿调控因子。SIRT1是Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶,它依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)跟底物上的乙酰基结合从而发挥其去乙酰化作用,其底物不仅包括组蛋白,还包括非组蛋白。通过调控不同的靶基因,SIRT1的去乙酰化作用与能量代谢、自噬、炎症和癌症等生物学以及病理学过程有着密切联系。然而由于肿瘤类型以及参与的信号通路不同,SIRT1在癌症发展中的作用存在着争议。我们先前的研究证明SIRT1在胃癌里的表达是下调的,它通过NF-κB/细胞周期蛋白D1信号通路,抑制胃癌中细胞周期蛋白D1的表达,进而诱导增殖中的胃癌细胞停滞于G1期,从而抑制胃癌的发展。过去诸多研究表明SIRT1与各类肿瘤的发生及发展有着密切相关性。除增殖外,SIRT1还参与了癌症的侵袭和转移。SIRT1通过对Smad4发挥去乙酰化作用,进而抑制TGF-β信号通路中MMP7(Smad4的靶基因)的作用,这样SIRT1在乳腺癌和口腔癌中就具有了抑制细胞的迁移和肿瘤转移的意义。在肺癌和卵巢癌中,SUMO E3连接酶PIASy通过减少Spl与SIRT1启动子的结合,抑制SIRT1的表达,进而促进肿瘤转移。也曾有报道,SIRT1促进癌基因——转录因子FOXM1蛋白酶体的降解,进而逆转乳腺癌中营养传感器 O-linked-β-N-acetylglucosamine(O-GlcNAc)转移酶(OGT)介导的侵袭和转移。然而在胃癌中SIRT1对侵袭和转移的作用及其调控机制尚不清楚。在此次研究中,我们探究了 SIRT1在胃癌浸润和转移中所发挥的作用及其下游靶基因。我们发现SIRT1在体内、外都抑制胃癌的侵袭和转移。接下来,我们通过mRNA微阵列技术对其下游靶基因进行筛选,并通过多种胃癌细胞系对筛选结果进行验证,同时对SIRT1调控靶基因的具体机制进行了进一步探究。研究目的:探究SIRT1在胃癌浸润转移过程中的功能及具体调控机制,为治疗胃癌提供新的靶点。研究方法和结果:1.为了检测SIRT1对胃癌细胞迁移和侵袭的影响,我们利用SIRT1过表达及干扰的慢病毒稳转胃癌细胞(AGS、BGC-823、MGC-803、HGC-27、SGC-7901),通过划痕实验和Transwell(无/有基质胶)实验,我们发现SIRT1能有效地抑制胃癌细胞迁移和侵袭。2.在裸鼠体内,分别用胃癌细胞系BGC-823的SIRT1过表达和干扰的稳转细胞及它们相应的对照稳转细胞进行裸鼠尾静脉注射,四周后处死裸鼠,取肺,称重,拍照,4%甲醛固定,HE染色,用于转移检查,我们发现在裸鼠体内SIRT1可以抑制胃癌细胞向肺部转移。3.为了在胃癌细胞中寻找SIRT1下游调控的基因,我们使用了 SIRT1过表达及干扰的慢病毒稳转BGC-823细胞及各自相应的对照细胞进行mRNA微阵列技术检测,对检测中发现的差异表达基因在多种稳转胃癌细胞系中选用qPCR技术及Western blot技术从mRNA和蛋白表达水平进行验证,筛选出了 SIRT1负向调控的下游基因ARHGAP5。4.利用生物信息学数据库JASPAR对ARHGAP5的启动子序列进行分析,预测到了转录因子c-JUN和RELA在ARHGAP5的启动子序列上的结合位点。在胃癌细胞系中转染上述转录因子的小干扰,用qPCR技术及Western blot技术证明了是转录因子c-JUN而不是RELA参与了胃癌细胞中ARHGAP5的表达调控。在SIRT1干扰的稳转胃癌细胞中干扰c-JUN的表达,发现ARHGAP5的表达发生了明显的回复,进一步证实转录因子c-JUN参与了 SIRT1调控的ARHGAP5的表达。为了进一步证实这一结论,我们在SIRT1稳转的胃癌细胞中进行了双荧光素酶实验。结果发现SIRT1抑制了 ARHGAP5启动子活性,即SIRT1在转录水平抑制了 ARHGAP5的表达。而且双荧光素酶实验还发现c-JUN在ARHGAP5启动子序列上的结合位点起作用,RELA在其上的结合位点不起作用。在胃癌细胞AGS中免疫共沉淀实验发现,SIRT1与转录因子c-JUN能够形成复合物。在慢病毒稳转的AGS细胞中进行免疫共沉淀实验检测SIRT1对c-JUN乙酰化水平的影响。发现SIRT1干扰的稳转细胞中c-JUN乙酰化水平增加,而SIRT1过表达的稳转细胞中c-JUN乙酰化水平明显降低。以上实验证实SIRT1不仅与转录因子c-JUN间存在结合,还对c-JUN发挥了去乙酰化作用。在胃癌细胞AGS中的ChIP实验结果表明:SIRT1被募集到转录因子c-JUN在ARHGAP5的启动子的结合位点上。在SIRT1干扰的稳转胃癌细胞AGS及其对照细胞中进行ChIP实验,qPCR实验结果显示:干扰SIRT1后SIRT1在ARHGAP5启动子区的结合明显减少,转录因子c-JUN在ARHGAP5启动子区则大量聚集。以上结果证实,SIRT1被募集到ARHGAP5的启动子上,与转录因子c-JUN结合,对其发挥了去乙酰化作用,从而抑制了转录因子c-JUN的转录活性以及ARHGAP5的表达。5.通过对Oncomine数据库中相关数据分析发现,不同类型胃癌中ARHGAP5的表达高于正常的胃组织。在TCGA数据库的数据分析发现,胃癌中ARHGAP5的表达也明显高于正常胃组织。来自NCBI GEO的数据(GSE63089和GSE13195)分析,我们发现ARHGAP5在胃癌中的表达明显高于其癌旁组织。为了检测ARHGAP5的表达水平,我们使用了石蜡包埋的含有90例胃癌患者癌组织和对应癌旁组织的石蜡组织芯片进行免疫组化实验。染色结果显示在癌旁组织中ARHGAP5的表达明显偏低,其中有四例患者的癌旁组织没有着色。但是在癌组织中,ARHGAP5的表达是明显增强的。以上对不同数据库的数据分析及实验结果统计证明,在胃癌组织中ARHGAP5的表达是明显上调的。我们的实验结果还显示ARHGAP5的表达与肿瘤大小(p =0.003)、肿瘤浸润程度(T期,p0.001)、局部淋巴结转移(N期,p = 0.003)以及临床分期(TNM分期,p＜ 0.001)等临床病理特征有显著相关性;我们使用单变量Cox回归进行分析发现:肿瘤大小(p = 0.003)、肿瘤浸润程度(T期,p = 0.004)、局部淋巴结转移(N期,p = 0.002)、临床分期(TNM分期,p = 0.002)以及ARHGAP5的表达水平(p0.001)与病人的生存预后显著相关;此外,利用多因素Cox回归分析进一步确认肿瘤浸润程度(T期,p = 0.013)、局部淋巴结转移(N期,p= 0.008)以及ARHGAP5的表达(p = 0.001)是胃癌病人生存预后的独立预测因子;根据ARHGAP5的表达水平绘制患者生存曲线来比较患者的预后。高表达ARHGAP5的胃癌患者的生存状况明显差于低表达ARHGAP5的胃癌患者。对TCGA数据库中胃癌病例信息进行生存分析,分析结果显示肿瘤中高表达ARHGAP5的患者术后生存期较短;来自Kaplan-Meier Plotter数据库对胃癌患者的生存信息分析显示,肿瘤中低表达ARHGAP5的胃癌患者拥有较长生存期。此外,在Kaplan-Meier Plotter数据库中,当我们将淋巴结转移也纳入总体生存分析中时,发现存在淋巴结转移的胃癌患者中,ARHGAP5的表达水平对生存期的影响依然显著,ARHGAP5的高水平表达对患者的预后是不利的。从以上数据分析可以看出,高表达的ARHGAP5与胃癌进展之间存在潜在联系。6.利用ARHGAP5的特异小干扰转染胃癌细胞AGS和BGC-823,利用qPCR技术及Western blot技术得到的结果显示ARHGAP5的mRNA和蛋白表达水平显著降低。用上述ARHGAP5干扰的胃癌细胞进行Transwell实验(无/有基质胶),结果表明胃癌细胞中ARHGAP5表达下调抑制了胃癌细胞的的迁移和侵袭。利用ARHGAP5的特异小干扰转染SIRT1干扰的慢病毒稳转胃癌细胞(AGS和BGC-823)及各自相应对照细胞,Western blot技术再次验证小干扰的有效性。Transwell实验(无/有基质胶)再次证实,ARHGAP5的下调抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭,有力的回复了由于SIRT1表达降低诱导的胃癌细胞的迁移和侵袭。结论:SIRT1在体外可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭,在动物体内同样也可以抑制胃癌细胞的转移。通过mRNA微阵列技术筛选出了 SIRT1下游靶基因——ARHGAP5。我们通过双荧光素酶实验、免疫共沉淀实验和ChIP实验证实:SIRT1能够与转录因子c-JUN进行结合,并对其发挥去乙酰化作用。SIRT1被募集到了ARHGAP5的启动子上,从而抑制了转录因子c-JUN的转录活性以及ARHGAP5的表达。数据库数据分析及组织芯片结果表明ARHGAP5在胃癌中的表达是明显增强的;统计学分析显示,ARHGAP5的表达与患者的肿瘤大小、肿瘤浸润程度、局部淋巴结转移以及临床分期等临床病理特征有显著相关性;Cox回归分析发现,ARHGAP5的表达水平与胃癌病人的生存预后关系密切,ARHGAP5可以作为胃癌病人生存预后的一个独立预测因子;另外来自数据库数据分析以及临床标本实验数据统计得到的生存分析发现,高表达的ARHGAP5对患者生存不利。不管是通过数据库数据分析还是所收集的临床样本结果都可以看出,高表达的ARHGAP5与胃癌进展之间存在潜在联系。癌细胞功能实验的验证结果表明,在胃癌中下调基因ARHGAP5的表达抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭。此外,在SIRT1干扰的慢病毒稳转及其对照的胃癌细胞中干扰ARHGAP5的表达,能够显著抑制胃癌细胞迁移和侵袭,并且能够明显的回复由于SIRT1表达降低诱导的胃癌细胞的迁移和侵袭。综上所述,SIRT1通过转录因子c-JUN调控基因ARHGAP5表达的机制可能为今后胃癌的预防和治疗提供新的靶点。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2
【图文】：

胃癌细胞,过表达

毒ｓｈＲＮＡ及其对照，分别记作ＬＶ－Ｓｉ和ＬＶ－Ｃｉ。我们用划痕实验检测胃癌细胞的逡逑迁移能力，在划痕Ｏｈ、１６ｈ和２４ｈ时拍照记录。结果显示：过表达的ＳＩＲＴ１抑制逡逑了胃癌细胞的迁移，ＳＩＲＴ１干扰后促进了细胞的迁移（图１、Ａ和Ｂ，图２、Ａ逡逑和Ｂ）。ＳＩＲＴ１对胃癌细胞迁移的抑制作用也通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验（无基质胶）逡逑进行了验证（图１、Ｃ和Ｄ，图２、Ｃ和Ｄ）。此外，我们还通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验逡逑（有基质胶）对胃癌细胞的侵袭能力进行了评估。发现：ＳＩＲＴ１过表达后胃癌细胞逡逑侵袭能力受到抑制，而ＳＩＲＴ１千扰后有利于胃癌细胞侵袭（图１、Ｃ和Ｄ）。综逡逑上所述，我们的结果表明ＳＩＲＴ１在体外对胃癌细胞的迁移和侵袭有抑制作用。逡逑４２逡逑

胃癌细胞,过表达

胃癌,裸鼠,小鼠

细胞（５＞＜１0３个／只）被尾静脉注入免疫缺陷的裸鼠体内。４周后，处死小鼠，取逡逑月市，拍照，称重，４％甲醛固定，ＨＥ染色，用于转移检查。注射ＳＩＲＴ１过表达胃逡逑癌细胞组的小鼠肺的外观大小及重量比对照组小得多（图３、Ａ和Ｂ）。通过组逡逑织切片染色后发现，注射ＳＩＲＴ】过表达细胞组的裸鼠肺中出现较少转移（图３、逡逑Ｃ）。与此相反，注射ＳＩＲＴ１干扰细胞组的小鼠肺明显比对照组大且重（图３、逡逑Ａ和Ｂ），而且在裸鼠肺内出现了较对照组更多的转移灶（图３、Ｃ）。因此，逡逑上述数据提示Ｓ１ＲＴＩ可以抑制体内胃癌细胞的转移。逡逑Ａ逦Ｂ邋Ｎｏｒｍａ｜邋ＬＶ－Ｃ邋ＬＶ－Ｓ邋ＬＶ－Ｃｉ邋ＬＶ－Ｓｉ－１邋ＬＶ－Ｓｉ－２逡逑°邋Ｎｏｒｍａｌ邋ＬＶ邋Ｃ邋ＬＶ邋Ｓ邋ＬＶ＊．Ｃｉ邋ＬＶ．Ｓｉ．，ＬＶ．ｂ．２逡逑ｎ逡逑ｗ邋Ｎｏｒｍａｌ逦ＬＶ－Ｃ逦ＬＶ－Ｓ逦ＬＶ－Ｃｉ逦ＬＶ＾ｉ－１逦ＬＶ－Ｓｉ－２逡逑l#尽媝＿逡逑图３、ＳＩＲＴｌ抑制胃癌在体内的转移。将慢病毒稳转的ＢＧＣ－８２３细胞（５ｘｌ0３个／逡逑只）通过尾静脉注射到裸鼠体内。四周后，小鼠处死，不做任何处理的裸鼠看作逡逑是正常。（Ａ）裸鼠取肺并称重评估。数据表示形式为：平均值±标准差。有统逡逑汁学意义的结果用＊标注，＊＊＊代表ｐ＜０．００ｌ。（Ｂ）各组肺的代表性图片。（Ｃ）逡逑有转移结节的肺苏木素－伊红染色。放大倍数：上面一组放大倍数＞＜４０倍，下面逡逑一组放大倍数ＸＩ００倍。逡逑３．

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