二氢青蒿素对肝癌细胞HepG2.2.15的作用及其分子机制探究

发布时间：2020-07-12 11:52

【摘要】：研究背景:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)指肝细胞发生了癌变而形成的恶性肿瘤,是肝癌的主要组成部分,因此简称为肝癌。肝癌发病隐匿、恶性程度高,且不易早期发现,导致其治疗效果欠佳。目前药物治疗依然是肝癌除手术之外的主要治疗途径。然而目前的化疗药物并不能对所有肝癌患者都有较好的疗效,因此寻找新的抗肝癌药物十分重要。青蒿素是从黄花蒿叶中提取出来的一种有效的抗疟疾成分。二氢青蒿素(Dyhidroartemisinin,DHA)是青蒿素的衍生物,不仅有较强的抗疟疾作用,还有明显的抗肿瘤活性。研究表明,DHA可通过调节细胞miRNA水平,调控细胞凋亡和自噬水平,介导细胞DNA损伤与修复而发挥抗癌活性。然而,其抗癌的具体分子机制仍未明确。端粒保护蛋白TPP1是维持端粒结构的完整性和基因组稳定性方面的“中坚力量”,抑制TPP1表达可以通过诱导DNA损伤反应(DNA Damage Response,DDR)而影响肿瘤的发生、发展。研究表明,端粒功能障碍能诱导人成纤维细胞系中的自噬流,经紫外线照射的黑色素细胞的DDR可以调控自噬。研究发现,DHA能调控多种细胞自噬。因此,DHA的作用机制可能与自噬及DNA损伤有密切关系。那么,DHA是否可以通过调控肝癌细胞HepG2.2.15的DNA损伤与自噬而影响细胞的生物学行为呢?基于上述科学设想,本研究拟通过探讨DHA对肝癌细胞HepG2.2.15自噬和DNA损伤的影响,以及调控TPP1的表达对Hep G2.2.15细胞自噬和DNA损伤的影响,初步阐述DHA对HepG2.2.15细胞生物学行为的影响及其分子机制,为HCC的治疗提供新思路。研究目的:1.探讨二氢青蒿素对肝癌细胞HepG2.2.15生物学行为的影响。2.探讨二氢青蒿素作用于HepG2.2.15细胞的潜在分子机制。研究方法:1.二氢青蒿素作用于HepG2.2.15细胞后,再用CCK8、结晶紫实验、Transwell实验、细胞划痕实验、平板克隆形成实验及软琼脂糖克隆形成实验分别检测细胞的增殖能力、迁移能力及克隆形成能力。2.转染外源性GFP-LC3质粒用于观察二氢青蒿素作用于HepG2.2.15细胞后LC3发生的转位,β-gal染色实验检测二氢青蒿素作用于HepG2.2.15细胞后细胞的衰老状况;3.Western Blot检测二氢青蒿素作用于肝癌细胞HepG2.2.15后,PI3K/AKT/mTOR细胞信号通路中AKT,mTOR,p70S6K,4EBP1的磷酸化蛋白水平以及自噬相关蛋白LC3,p-AMPK,p62的表达差异;DDR信号通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21表达情况;细胞端粒保护蛋白TPP1的表达水平;4.构建含靶向TPP1的慢病毒介导的sh RNA表达质粒PHBLV-U6-PURO-shTPP1(简称shTPP1);shTPP1感染HepG2.2.15细胞,Western Blot及Real-time PCR检测shTPP1对HepG2.215细胞TPP1的蛋白及mRNA表达的抑制作用。5.抑制TPP1表达后,用结晶紫实验、Transwell实验、细胞划痕实验、平板克隆形成实验及软琼脂糖克隆形成实验检测HepG2.2.15细胞的增殖、迁移及克隆形成能力的变化;Western Blot检测DDR信号通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21的表达,PI3K/AKT/mTOR信号通路中AKT,mTOR,p70S6K,4EBP1的磷酸化蛋白水平的表达,细胞自噬相关蛋白LC3,pAMPK,p62的表达水平。结果:1.二氢青蒿素作用于HepG2.2.15后细胞的生长、增殖、迁移及克隆形成能力明显下降;2.二氢青蒿素能促进HepG2.2.15细胞中外源性GFP-LC3蛋白发生转位;3.β-gal染色实验结果显示二氢青蒿素能诱导HepG2.2.15细胞衰老;4.Western Blot结果显示二氢青蒿素下调HepG2.2.15细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-AKT,p-m TOR,p-p70S6K,p-4EBP1的表达;上调自噬相关蛋白LC3,p-AMPK,p62以及DDR信号通路中p-ATM,p-ATR,γ-H2AX,p53,p21蛋白的表达。5.二氢青蒿素明显下调Hep G2.2.15细胞端粒保护蛋白TPP1表达水平;6.琼脂糖凝胶电泳及DNA测序显示shTPP1质粒构建成功,Western Blot及Real-time PCR结果显示shTPP1能有效抑制Hep G2.2.15细胞TPP1蛋白及mRNA表达水平;7.利用shTPP1抑制TPP1表达后,HepG2.2.15细胞的生长、增殖、迁移及克隆形成能力明显下降;DDR信号通路中p-ATM,γ-H2AX,p53,p21蛋白及自噬相关蛋白LC3,p AMPK,p62表达增加;PI3K/AKT/mTOR信号通路中p-AKT,p-mTOR,p-p70S6K,p-4EBP1蛋白表达降低。结论:1.二氢青蒿素在肝癌细胞中具有显著抗肿瘤作用;2.二氢青蒿素在肝癌细胞中抗肿瘤作用机制可能为:抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬;下调端粒保护蛋白TPP1的表达,激活DDR信号通路诱导细胞衰老等。3.二氢青蒿素可能作为肝癌治疗潜在的抗肿瘤药物,对于临床应用还需进一步深入研究和验证。
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

肝癌,细胞的,细胞,生长情况

A B图 1. 二氢青蒿素对肝癌 HepG2.2.15 细胞的生长的影响。注：DMSO:对照组，DHA:实验组。A. DMSO 和二氢青蒿素处理肝癌 HepG2.2.15 细胞 24 h 和 48 h后细胞的生长情况（X200）。B. 不同浓度的 DHA 作用于肝癌 HepG2.2.15 细胞不同时间后抑制作用的变化。

生长曲线,肝癌细胞,活力,处理组

B二氢青蒿素对肝癌细胞 HepG2.2.15 增殖活力的影响。DHA：实验组。A.结晶紫染色法绘制生长曲线检测二。B.DMSO 和 DHA 处理 48 h 后经结晶紫染色后扫描六孔肝癌细胞 HepG2.2.15 迁移能力的影响癌细胞 HepG2.2.15 后，利用 Transwell 实能力的影响。显微镜下观察和多视野计数细胞穿过数量明显低于 DMSO 处理组(图行计数后统计分析发现，差异具有统计学意验观察 DHA 处理组和 DMSO 处理组细胞迁移的距离，同样显示 DHA 处理组细胞迁

迁移能力,肝癌细胞,小室

C图 3. 二氢青蒿素抑制肝癌细胞 HepG2.2.15 的迁移能力。注：DMSO：对照组，DHA：实验组。A. Transwell 实验检测二氢青蒿素对肝癌细胞 HepG2.迁移能力的影响( X200)，红色箭头指示穿过 Transwell 小室的 HepG2.2.15 细胞。B.Transwell 小室的 HepG2.2.15 细胞定量分析，统计数据以 mean ± SD 作图，N=3。**p＜0

【参考文献】