毛囊间充质干细胞表型极化及其对黑色素瘤B16细胞增殖凋亡的影响

发布时间：2020-07-16 03:17

【摘要】：研究背景:毛囊位于体表,是皮肤的附属器之一,常常受到外界环境中物理、化学和生物因素的作用,而发生病理改变,如:脱发和失去色素。研究表明毛囊中含有间充质干细胞(Human hair follicle-derived mesenchymal stem cells,hHF-MSCs)、黑色素干细胞、神经嵴干细胞和角朊干细胞。这些干细胞在时空上协同作用,维持毛囊的自我更新和毛囊周期的正常运行。同其它来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)类似,hHF-MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105,具有成骨、成脂和成软骨分化潜能。我们成功地利用人毛囊来源干细胞原位修复了慢性皮肤溃疡,治愈了白癜风,构建了组织工程小口径血管,制备出表达产物释放可控转基因干细胞,成功地逆转了糖尿病高血糖。尽管干细胞在再生医学中的作用越来越引起世人的关注,但干细胞的安全性、有效性和伦理是干细胞生物学与再生医学研究和应用不可回避的现实问题。特别是干细胞的安全性问题一直备受医务工作者关注~([1])。研究发现,MSCs通过分泌免疫因子和炎症因子,抑制或促进肿瘤的生长。但hHF-MSCs是否通过旁分泌,具有促进或抑制肿瘤生长作用,目前尚未见报道。毛囊干细胞来源丰富、获取方便且可重复获取等优势,成为组织修复、器官重建和基因治疗重要的种子细胞来源。为了发挥毛囊干细胞来源优势,充分利用毛囊干细胞在再生医学中作用,探究毛囊干细胞促进或抑制肿瘤生长作用具有重要的科学意义和应用价值。Toll样受体(TLRs)是指免疫细胞和非免疫细胞在质膜或细胞内(内小体)表达的Ⅰ型膜蛋白。免疫细胞指的是T、B细胞以及固有免疫细胞(主要包括单核/巨噬细胞、NK细胞、中性粒细胞和肥大细胞等)。非免疫细胞指各种上皮、内皮细胞、MSCs等等~([1])。虽然TLRs在免疫系统广泛分布,但是不同来源细胞的TLRs表达水平并不相同。研究表明人脂肪组织间充质干细胞(AT-MSCs)和人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)表达TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6和TLR9。虽然BM-MSCs和AT-MSCs均表达TLR4,但脐带来源的间充质干细胞(Wharton Jelly-derived stem cells,WJ-MSCs)缺乏TLR4的表达~([2-5])。一些配体可以特异性与TLRs结合受体,激活其下游通路,产生活性氧(ROS)的、释放细胞因子,进而产生相应的生物学效应。通过利用Poly I:C激活TLR3受体,使MSCs向MSC2表型极化,释放抗炎因子IL4、IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3,维持组织内环境的稳定;利用脂多糖LPS激活TLR4受体,使MSCs向MSC1表型极化,释放促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα引起局部炎症反应,杀灭、清除炎症部位的病原体及异物等。由此可见利用外来配体与MSCs上TLR3和TLR4特异性结合,来间接调控微环境,调控肿瘤细胞的增殖和凋亡~([6-8])。鉴于MSCs的极化与TLRs表达有关,我们以体外诱导hHF-MSCs表达TLR4或TLR3,使其极化为hHF-MSC1和hHF-MSC2为出发点,探讨极化后的hHF-MSCs是否具有抑制或者促进黑色素瘤细胞(B16)增殖或凋亡作用。目的:体外诱导HF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2极化,探讨hHF-MSC1或和hHF-MSC2对黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡作用。方法:1.通过直接拔取志愿者毛发的方式获取毛囊的方法,获得hHF-MSCs。采用免疫荧光染色结合流式细胞技术,检测hHF-MSCs表面标志物CD44、CD73、CD90、CD105的表达。利用油红O和茜素红染色检染色检测hHF-MSCs的成脂、成骨分化潜能。2.通过分别与LPS和Poly I:C作用,诱导hHF-MSCs极化为hHF-MSC1和hHF-MSC2。采用细胞免疫荧光染色结合流式细胞技术以及Western blot检测hHF-MSC1和hHF-MSC2上TLR3和TLR4表达。利用PCR技术检测,在mRNA水平检测hHF-MSC1或hHF-MSC2促炎症因子和抗炎症因子表达。利用MTT和流式细胞技术检测hHF-MSC1和hHF-MSC2细胞增殖和周期的改变,并与hHF-MSCs比较。3.将hHF-MSC1或hHF-MSC2的上清与B16细胞共培养。利用MTT和细胞免疫荧光技术检测hHF-MSC1或hHF-MSC2上清对黑色素瘤B16增殖和凋亡影响。结果:1.hHF-MSCs的分离、培养及鉴定通过直接拔取志愿者头部后枕部毛囊,获得hHF-MSCs。显微镜下观测hHF-MSCs呈长梭形,鱼群样生长。免疫荧光染色以及流式细胞检测发现hHF-MSCs表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD31。油红O及茜素红染色显示,hHF-MSCs具有成脂、成骨分化潜能。2.毛囊间充质干细胞极化及相关炎症因子的检测在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs极化成hHF-MSC1或hHF-MSC2。免疫荧光及流式细胞仪检测发现:在LPS或Poly I:C作用下,hHF-MSCs表达TLR4或TLR3的百分比增加,与未极化组比,具有显著性差异。Western blot结果与流式细胞仪检测结果类似。PCR检测发现LPS和Poly I:C分别上调促炎因子IL6、CXCL8、IL1β、TNFα和抗炎因子IL10、CSF1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3的表达。QPCR检测发现LPS和Poly I:C分别上调促炎因子CXCL8、TNFα和抗炎因子IL10、TGFβ1的表达。MTT检测发现在给定的剂量下,LPS和Poly I:C对hHF-MSCs增殖影响与对照组比无显著差异。3.毛囊间充质干细胞极化对黑色素瘤B16增殖凋亡的影响收集hHF-MSC1、hHF-MSC2、hHF-MSCs的同化培养基,与黑色素瘤细胞B16共培养。MTT和细胞免疫荧光技术检测发现hHF-MSC1同化培养基抑制黑色素瘤细胞B16细胞的增殖,促进其凋亡;而hHF-MSC2同化培养基促进黑色素瘤B16细胞的增殖,抑制其凋亡,与hHF-MSCs同化培养基比,均具有统计学差异(P0.05)。结论:通过LPS或Poly I:C诱导hHF-MSCs向hHF-MSC1或hHF-MSC2极化。hHF-MSC1或hHF-MSC2通过旁分泌作用抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖、促进凋亡作用或促进B16细胞增殖,抑制其凋亡。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5
【图文】：

志愿者,毛发,纤维,细胞

18.2 hHF-MSCs 的鉴定.2.1 hHF-MSCs 细胞表面标志物检测（细胞免疫荧光）细胞免疫荧光染色结果显示， hHF-MSCs 表达 CD105、CD90、CD73 和44，不表达 CD31。结果图 2 所示。第 8 代 hHF-MSCs第 8 代 hHF-MSCsA.通过拔取志愿者毛发，采用组织块发培养 hHF-MSCs 6 天后，有成纤维样细胞爬出(100养后 hHF-MSCs 呈长梭形，鱼群样排列。培养第 8 代 hHF-MSCs(B.40×C.100×)

流式细胞术,表面标志,免疫荧光,标志物

1.3.2.2 hHF-MSCs 细胞表面标志物检测（流式细胞术）流式细胞术检测结果显示，hHF-MSCs 表达 CD44、CD90、CD105 和 CD73，阳性率分别为 86.94%、89.58%、91.25%、 89.86%，而基本不表达 CD31 内皮细胞标志物，如图 3 所示。图 2 免疫荧光显示 hHF-MSCs 表达 CD44、CD90、CD73、CD105, 不表达 CD31（100×）

免疫荧光,流式细胞术,标志物

【参考文献】