二甲双胍诱导miR-378下调CDK1水平抑制肝细胞肝癌的细胞增殖

发布时间：2020-07-19 23:32

【摘要】：背景:原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤,亚洲、非洲和南部欧洲都是其高发地区,其中中国的病例占全球肝癌病例的50%以上。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在原发性肝癌中最为常见,其恶性程度高、发病隐匿、易转移和复发,目前的治疗方案主要以手术为主的综合治疗。但大多数肝细胞肝癌患者在确诊时已处于晚期,无法行手术治疗,总体预后不良。二甲双胍目前临床应用最广泛的口服降糖药之一,越来越多的流行病学证据表明二甲双胍与各种癌症风险降低有关,最近的研究证实二甲双胍对肝细胞癌(HCC)具有抗肿瘤作用。然而,其具体分子机制有待进一步研究。目的:研究二甲双胍对肝癌细胞增殖、凋亡的影响,寻找二甲双胍对肝癌细胞增殖、凋亡影响的分子途径及可能的作用机制,为发现新的肿瘤生物标记物、改善肝细胞肝癌的早期诊断及治疗提供新思路。方法:1.CCK-8(cell counting kit-8)及流式细胞术分别检测二甲双胍对肝癌细胞的增殖及凋亡的影响,Real-time PCR检测miR-378、CDK1 m RNA的表达水平的变化,Western blot检测CDK1蛋白表达水平的变化。2.体外转染miR-378 mimic以过表达miR-378,Real-time PCR检测转染效率。通过CCK-8及流式细胞术检测过表达miR-378对肝癌细胞的增殖及细胞周期的影响。3.生物信息学预测CDK1与miR-378可能存在的结合位点并构建CDK13’-UTR区域启动子表达载体,用萤光素酶报告基因方法进行验证。通过Real-time PCR与Western blot检测过表达miR-378对CDK1 m RNA及其蛋白表达水平的影响。4.通过Real-time PCR检测通过转染技术小鼠体内过表达miR-378的效率,Western blot技术检测小鼠体内过表达miR-378对CDK1 m RNA和蛋白表达水平的影响。5.通过Western blot、CCK-8及流式细胞法观察miR-378 inhibitor能否逆转二甲双胍对CDK1表达、细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。结果:1.二甲双胍抑制HCC细胞增殖伴随CDK1 m RNA和蛋白表达水平的降低和miR-378表达水平的上调。2.体外过表达miR-378抑制HCC细胞增殖。3.miR-378通过靶向CDK1 3'-UTR区域而直接抑制其表达。4.体内过表达miR-378能抑制肿瘤生长并下调CDK1的表达水平。5.二甲双胍通过促进HCC细胞中的miR-378水平抑制CDK1表达和细胞增殖。结论:二甲双胍诱导miR-378靶向下调CDK1水平并抑制肝细胞肝癌的细胞增殖。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
【图文】：

40图 3. MiR-378 通过靶向其 3'-UTR 直接抑制 CDK1 的表达。（A 和 B） miRNA 预测网站和双荧光素酶报告基因测定结果显示miR-378和CDK1之间的结合位点。（C和D）miR-378过表达降低了 CDK1 mRNA 和蛋白质水平。数据表示为 mean±SD，n = 3，*P <0.05。3.4 讨论CDK 即周期蛋白依赖性蛋白激酶，是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CDK可以和 cyclin 结合形成异二聚体，其中 cyclin 为调节亚基，CDK 为催化亚基，不同的复合物，通过 CDK 活性，催化不同底物磷酸化，而实现对细胞周期不同

南京医科大学博士毕业论文我们用 Real-time PCR 法检测了 mimic 组和 NC 组的肿瘤组织中 miR-378 表达水平，结果发现，mimic 组瘤组织中 miR-378 的表达水平与对照组相比显著上调（图 4C）。4.3.3 Western blot 检测 miR-378 mimic 组肿瘤组织中 CDK1 表达水平我们提取了瘤组织总蛋白，Western blot 结果显示，与体外结果相一致，miR-378 mimic 组瘤组织中 CDK1 的蛋白表达水平较 NC 组相比显著下调（图 4D）。

miR-378-inhibitor 转染的 HepG2 细胞的增殖速率与正常肝癌细胞增殖速度相似。这表明，HepG2 细胞经二甲双胍培养引起的细胞增殖抑制被转染 miR-378inhibitor 后逆转（图 5B）。5.3.3 细胞周期测定分析 miR-378 inhibitor 对细胞增殖影响二甲双胍可以引起 HepG2 细胞 G2/M 期周期阻滞显著增强，而给予miR-378-inhibitor 转染后能逆转由二甲双胍引起的 G2/M 阻滞（19%-10.4%）（图5C）。5.3.4 细胞凋亡分析 miR-378 inhibitor 对细胞增殖影响二甲双胍可以引起 HepG2 细胞凋亡率显著上调，而给予 miR-378 inhibitor转染后则不能逆转由 miR-378 inhibitor 引起的细胞凋亡（图 5D）。

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本文编号：2763120