RNAi介导的ATAD2表达沉默对人结肠癌细胞恶性行为的影响及机制研究

发布时间：2020-07-23 09:42

【摘要】：结肠癌是一种临床常见恶性肿瘤,在女性及男性肿瘤发病率中分别位居二、三位,在西方发达国家,随着早期人群干预的开展,结肠癌发病率已趋于稳定或下降趋势,但在发展中国家仍不断上升。随着社会经济发展、居民生活方式转变,以及人口老龄化的加剧,在我国,目前结肠癌已经成为威胁人民生活健康的重要疾病之一,显示逐年增长趋势,且发病年龄有所提前。在过去几年,结肠癌的治疗已取得较快的进展,但是,由于发病的隐匿性及症状的不典型,导致很多结肠癌患者就诊时已达中晚期,死亡率一直居高不下,其原因主要为肿瘤的浸润和转移。结肠癌的发生发展涉及到多种基因的改变,因此,如何筛选结肠癌预后标志物并进行针对性干预则成为当务之急。三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPasefamilyAAAdomain-containingprotein2,ATAD2)参与调控其靶基因的转录,进而调节细胞周期调控、信号转导,其表达异常通常与恶性肿瘤发生和发展相关。有研究表明,与癌旁组织相比,ATAD2在结肠癌组织中呈现异常高表达;而且RNA干扰技术(RNAi)介导的ATAD2下调已被证实可抑制多种癌细胞的增殖和侵袭转移。但对于ATAD2在结肠癌进展中的作用尚不明确。为研究ATAD2基因在结肠癌发生及进展中的作用,本研究计划通过RNA干扰技术沉默人结肠癌细胞Caco-2与SW480中ATAD2的表达,探讨ATAD2表达下调对结肠癌细胞增殖、侵袭迁移能力以及体内肿瘤形成能力的影响及作用机制,为结肠癌发病机制及肿瘤基因治疗研究提供治疗靶点以及理论依据。我们的研究内容主要由以下几个方面:一、ATAD2基因沉默对结肠癌细胞增殖及细胞周期的影响1、ATAD2shRNA重组表达载体的构建根据GenBank登录ATAD2基因(XM_011516994)保守序列以及参考Ambin公司网站提供的RNAi设计软件确定ATAD2靶位点,并设计合成ATAD2-shRNA(shATAD2)寡核苷酸,与酶切后载体pRNA-H1.1质粒连接重组,测序鉴定。2、ATAD2基因沉默稳定克隆的筛选与鉴定利用脂质体法将pRNA-H1.1-shATAD2及对照shCtr质粒瞬转结肠癌细胞Caco-2及SW480,经G418抗性筛选获得稳转细胞系,荧光定量PCR及WesternBlot分别检测ATAD2mRNA及蛋白表达,鉴定ATAD2基因沉默稳定克隆筛选成功。3、ATAD2基因沉默对细胞增殖及细胞周期的影响分别利用CCK8及平板克隆实验检测细胞增殖及克隆形成能力,结果显示:与未转染细胞Caco-2-wt、SW480-wt及转染对照组Caco-2-shCtr、SW480-shCtr相比较,ATAD2基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2细胞中细胞增殖能力均显著下调,克隆形成能力收到抑制(P0.05);流式细胞术检测细胞周期变化情况,实验结果显示:ATAD2基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2组细胞G1期显著增加,S期所占比例减少,提示ATAD2基因沉默使结肠癌细胞周期阻滞于G1期。4、ATAD2基因沉默对细胞增殖及细胞周期影响的相关机制利用荧光定量PCR及WesternBlot分别检测ATAD2基因沉默对细胞增殖、周期相关基因及蛋白表达的影响,实验结果显示ATAD2基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2组细胞增殖相关因子PCNA、C-myc、Ki67等mRNA及蛋白表达水平均下调,Akt磷酸化程度降低,信号通路活性受到抑制;细胞周期相关因子CyclinD1、CyclinE1、CDK2基因mRNA表达水平显著下调,抑癌基因p21mRNA表达水平显著上升,提示ATAD2基因沉默能够抑制细胞增殖相关基因的表达以及相关信号通路的活化。二、ATAD2基因沉默对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响1、ATAD2基因沉默抑制结肠癌细胞迁移及侵袭采用细胞划痕及Transwell小室分别检测ATAD2基因沉默后结肠癌细胞的迁移及侵袭能力变化,结果显示:与未转染组及转染对照组相比,ATAD2基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2划痕愈合能力以及侵袭能力均显著下降,提示ATAD2基因沉默能够抑制结肠癌细胞侵袭及迁移。2、ATAD2基因沉默对结肠癌细胞EMT进程的影响及机制通过荧光定量PCR、WesternBlot以及免疫荧光分别检测EMT相关指标变化情况,分析ATAD2基因沉默对结肠癌上皮间质转化过程的影响,结果显示,与对照组相比,ATAD2基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2细胞间质细胞标志物及细胞转录因子相关蛋白Vimentin、Slug、Snail等指标下调,上皮细胞标志物E-cadherin表达水平显著上升(P0.01),提示ATAD2基因沉默可能抑制结肠癌细胞上皮间质转换等生物学行为,进而抑制了肿瘤的恶性转化。3、ATAD2基因沉默影响细胞侵袭的可能机制为探索ATAD2基因沉默对结肠癌细胞侵袭能力影响的分子机制,采用WesternBlot检测基质金属蛋白酶MMP2、MMP9以及MMP13蛋白表达水平,并通过明胶酶谱对MMP2、MMP9进行活性检测,实验结果验证了ATAD2基因沉默能够降低MMP2、MMP9以及MMP13蛋白表达水平,并抑制MMP2、MMP9活性。三、ATAD2沉默对结肠癌体内移植瘤形成的影响1、建立裸鼠移植瘤模型将SW480-shATAD2以及对照SW480-shCtr细胞培养至对数生长期,分别向裸鼠腋窝皮下注射1×107/0.2ml肿瘤细胞,自接种之日起每天观察裸鼠状态、成瘤时间及瘤体生长情况。2、大体观察移植瘤形成情况在接种细胞后9天左右两组均开始出现可触及肿瘤硬结。与对照(shCtr)组相比,沉默(shATAD2)组肿瘤体积增长较为缓慢,四周后处死小鼠,取出瘤体进行称量,沉默(shATAD2)组瘤体重量显著降低。3、移植瘤生长曲线绘制自观察到裸鼠成瘤起,每三天用游标卡尺测量肿瘤结节的长径和短径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,结果显示:对照(shCtr)组裸鼠体内瘤组织增长迅速,而与对照(shCtr)组相比,沉默(shATAD2)组肿瘤体积增长较为缓慢,提示ATAD2基因沉默可能抑制结肠癌细胞在体内移植瘤的形成。4、肿瘤增殖相关因子检测提取两组肿瘤组织总RNA,通过荧光定量PCR检测瘤体内ATAD2基因及增殖相关基因PCNA、C-myc、Ki67mRNA表达水平,与shCtr组相比,shATAD2组细胞中ATAD2、PCNA、C-myc、Ki67表达水平显著下调(P0.01);免疫组化检测两组瘤组织中ATAD2基因及增殖相关基因Ki67mRNA原位表达情况,结果表明,与shCtr组相比,shATAD2组肿瘤组织中ATAD2、Ki67表达水平显著下调。结论:本论文通过细胞水平及动物体内水平研究验证发现,ATAD2基因沉默能够抑制结肠癌细胞增殖、侵袭及迁移,提示ATAD2表达在结肠癌发生发展中发挥重要作用,本研究为结肠癌基因治疗提供新的候选靶点及理论依据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【图文】：

效果图,稳定转染,基因沉默,结肠癌细胞

.1 荧光定量 PCR 检测 pRNA-H1.1- shATAD2 稳定转染结肠癌胞基因沉默效果：Caco-2 细胞组；B：SW480 细胞组；*P＜0.05 vs wt 组、** vs wt 组）2.1 Real-time PCR was performed to measure the expression levelsD2toevaluatethetransfectionefficiencyofATAD2shRNA.：Caco-2 cell lines group；B：SW480 cell lines group；*P＜0.0roup、**P＜0.01 vs wt group）2 Western Blot 检测稳定转染 pRNA-H1.1- shATAD2 对结肠 ATAD2 蛋白表达的影响

效果图,稳定转染,结肠癌细胞,蛋白

.2 WesternBlot检测pRNA-H1.1-shATAD2 稳定转染结肠癌细蛋白沉默效果（A、C：Caco-2 细胞组 ATAD2 蛋白表达情况；B、D：SW组ATAD2蛋白表达情况；*P＜0.05vswt 组、**P＜0.01vswt组2.2 Western Blot was performed to measure the expression leveD2toevaluatethetransfectionefficiencyofATAD2shRNA.（A：The ATAD2 protein expression in Caco-2 cell lines；B：D2 protein expression in SW480 cell lines；*P＜0.05 vs wt grou＜0.01 vs wt group）

癌细胞增殖,结肠癌细胞,基因沉默

第 2 章 ATAD2 基因沉默对结肠癌细胞增殖及细胞周期的影响2.3.3 CCK8 法分析 pRNA-H1.1- shATAD2 稳定转染对结肠癌细胞增殖能力的影响为分析 ATAD2 基因沉默对结肠癌细胞增殖能力的影响，将各组细胞接种 96 孔板，CCK8 法分别检测接种24h、48h、72h、96h 后细胞生长情况，结果如图2.3所示：在细胞接种后的每个时间点，与未转染细胞Caco-2-wt、SW480-wt 相比，转染对照组Caco-2-shCtr、SW480-shCtr中细胞增殖能力变化不明显；而ATAD2 基因沉默组Caco-2-shATAD2、SW480-shATAD2细胞中细胞增殖能力均显著下调（P＜0.05）。

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